吳 琴, 余家勝, 李 瑞, 沈珊珊, 楊佳雯, 趙志紅

(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 浙江省食品生物工程重點實驗室, 杭州 310018)

維生素是維持人和動物正常生理功能必不可缺的低相對分子質(zhì)量有機化合物,根據(jù)其物理特性可以分為水溶性維生素和脂溶性維生素。其中,脂溶性維生素主要包括維生素A(VA)、維生素D(VD)、維生素E(VE)、維生素K(VK)[1]。維生素A存在于動物性食品中,主要來源為視黃醇酯[2-3]。維生素E極易被氧化,是良好的脂溶性抗氧化劑[4-6]。缺乏維生素D會引起骨軟化等疾病[7-8]。維生素K有K1(VK1)、K2(VK2)兩種,維生素K1主要存在于綠葉蔬菜和一些食用油中[9],維生素K2主要由發(fā)酵食品中的細(xì)菌產(chǎn)生[10]。

不同脂溶性維生素的化學(xué)性質(zhì)存在一定差異,同時測定面臨許多問題和挑戰(zhàn)。提取維生素A、維生素D、維生素E的方法通常為皂化法[11],但是該方法不能用于皂化維生素K1和K2,因為這兩種物質(zhì)易在堿性條件下降解。國際公認(rèn)的提取嬰幼兒配方乳粉和成人/兒童營養(yǎng)食品中維生素A、維生素E的方法是先酶解,再用甲醇沉淀蛋白,最后用溶劑提取[12-13],且這種方法可用于提取維生素K1[14];提取食品和補充劑中的維生素D的方法仍為皂化法[15-16]。

隨著消費者對保健食品風(fēng)味要求的提高,其基質(zhì)也越來越復(fù)雜,因此建立一種準(zhǔn)確、快捷、經(jīng)濟的檢測復(fù)雜基質(zhì)保健食品中脂溶性維生素的方法很有必要。本工作采用酶解法降解復(fù)雜基質(zhì)保健食品中的脂肪、蛋白質(zhì),利用弱堿性乙醇溶液除去降解雜質(zhì),正己烷提取7種脂溶性維生素營養(yǎng)補充劑[維生素A乙酸酯、維生素A棕櫚酸酯、維生素D2(VD2)、維生素D3(VD3)、DL-α-維生素E乙酸酯、維生素K1和維生素K2],并參考文獻(xiàn)[17-18]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定這7種脂溶性維生素營養(yǎng)補充劑的含量,該方法前處理簡單,不需要復(fù)雜的皂化反應(yīng)和固相萃取小柱凈化,即可實現(xiàn)7種脂溶性維生素營養(yǎng)補充劑的同時測定。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC-Xevo TQ MS型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀,附Masslynx質(zhì)譜軟件;R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;XS205DU型電子天平;AS-MTV100-114型多管渦旋振蕩器;S470-K型pH計;WB 22型恒溫水浴振蕩器;XMTD-608型氮氣吹掃儀。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100 mg·L-1,取適量各脂溶性維生素營養(yǎng)補充劑標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中,搖勻備用。

基質(zhì)匹配單標(biāo)準(zhǔn)中間液:10 mg·L-1,取適量單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用空白樣品溶液稀釋,搖勻備用。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量基質(zhì)匹配單標(biāo)準(zhǔn)中間液,用空白樣品溶液稀釋,配制成維生素A乙酸酯、維生素A棕櫚酸酯、DL-α-維生素E乙酸酯的質(zhì)量濃度為50,100,200,500,1 000 μg·L-1,維生素D2、維生素D3、維生素K1和維生素K2的質(zhì)量濃度為10,20,40,100,200 μg·L-1的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

維生素K1(CAS號84-80-0)標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.6%;維生素K2(CAS號2124-57-4)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為100 mg·L-1;DL-α-維生素E乙酸酯(CAS號7695-91-2)標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98.8%;維生素A乙酸酯(CAS號127-47-9,)標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.8%;維生素A棕櫚酸酯(CAS號79-81-2)標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98.7%;維生素D3(CAS號67-97-0)標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.7%;維生素D2(CAS號50-14-6)標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.4%;脂肪酶的酶活力不小于30 U·mg-1;木瓜蛋白酶的酶活力不小于10 U·mg-1。

無水乙醇、碳酸鉀、正己烷、石油醚、乙醚均為分析純;甲醇、甲酸均為色譜純;試驗用水為實驗室一級用水。

1．2 儀器工作條件

1．2．1 色譜條件

Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫35 ℃;流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為含0.1%甲酸的甲醇溶液;流量0.3 μL·min-1;進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫程序:0～3.0 min時,B由85%升至100%,保持5.5 min;8.5～9.0 min時,B由100%降至85%,保持1.0 min。

1．2．2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI+)模式;離子源溫度150 ℃;毛細(xì)管電壓4.00 kV;脫溶劑氣溫度200 ℃;脫溶劑氣流量800 L·h-1,錐孔氣流量50 L·h-1;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab. 1 MS parameters

1．3 試驗方法

將樣品混勻,分取約1 g置于50 mL離心管中,加入約50 ℃溫水5 mL和磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) 5 mL,混勻后加入0.3 g脂肪酶、0.5 g木瓜蛋白酶,加蓋渦旋2～3 min,置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩120 min。取出酶解好的樣品溶液,加入10 mL無水乙醇和1 g碳酸鉀,混勻后加入10 mL正己烷和10 mL水,渦旋或振蕩提取10 min,以6 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5min,上層相轉(zhuǎn)移至100 mL旋蒸瓶中。在下層相中加入10 mL正己烷,重復(fù)上述提取和離心操作一次。合并上層相至旋蒸瓶中,于40 ℃旋蒸至近干,殘液用氮氣吹干,用甲醇溶解殘渣并定容至5 mL容量瓶中,搖勻后過0.22 μm濾膜,濾液上機檢測。對于目標(biāo)物檢出量超出線性范圍的樣品,需要先稀釋再測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 基質(zhì)的影響及消除

復(fù)雜基質(zhì)保健食品,如本工作研究的顆粒型保健食品,其中除了有維生素等營養(yǎng)補充劑外,還添加了大量的可可粉、全脂乳粉等進(jìn)行調(diào)味,脂類和蛋白類化合物含量較高。若采用有機溶劑直接提取,共存脂肪、蛋白質(zhì)也會被提取到提取液中,不僅影響維生素的測定,還會降低質(zhì)譜響應(yīng)值和縮短儀器使用壽命。本工作參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.158-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K1的測定》[19],先采用酶解法降解脂肪和蛋白質(zhì),酶解完成后加入無水乙醇、碳酸鉀、正己烷,使酶解產(chǎn)生的脂肪酸和甘油等降解雜質(zhì)溶于弱堿性的乙醇溶液中,而目標(biāo)物則留在了正己烷相,從而完成雜質(zhì)的分離和目標(biāo)物的提取。

2．2 酶解反應(yīng)條件的選擇

由相關(guān)文獻(xiàn)可知,脂肪酶酶活性可在pH 6.5～9.0、溫度25～40 ℃的條件下維持在較高的水平[20];木瓜蛋白酶酶活性在pH 6.8～7.6內(nèi)較高,在70 ℃以上才降低[21]。因此,試驗選擇在pH 7.0,溫度37 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。

參考本課題組前期研究[22],以空白加標(biāo)樣品(維生素A乙酸酯、維生素A棕櫚酸酯和DL-α-維生素E乙酸酯的加標(biāo)量為2.5 μg·g-1,維生素D2、維生素D3、維生素K1和維生素K2的加標(biāo)量為0.5 μg·g-1)為待測對象,固定脂肪酶用量為0.3 g,考察了木瓜蛋白酶用量分別為0.1,0.3,0.5,0.8,1.0 g時各目標(biāo)物的回收率,結(jié)果見圖1。

1-DL-α-VE乙酸酯;2-VK1;3-VA棕櫚酸酯;4-VD3;5-VA乙酸酯;6-VK2;7-VD2

由圖1可知,木瓜蛋白酶的用量不小于0.5 g時,各目標(biāo)物的回收率較高且基本保持不變,因此試驗選擇的木瓜蛋白酶的用量為0.5 g。

2．3 提取溶劑的選擇

脂溶性維生素可被多種有機溶劑提取,相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)采用體積比1∶1的石油醚-乙醚混合溶液提取皂化溶液中的維生素A、維生素D、維生素E[23],采用正己烷提取維生素K1[19];國家衛(wèi)生和計劃生育委員會相關(guān)公告采用異丙醇提取維生素K2[24]。本工作涉及的脂溶性維生素種類較多,因此比較了上述3種提取溶劑對7種目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 提取溶劑對目標(biāo)物回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvent on the recovery of targets

由圖2可知:以體積比1∶1的石油醚-乙醚混合溶液提取時,維生素A乙酸酯和維生素A棕櫚酸酯的回收率較大,但是維生素K1和維生素K2的回收率較小;以異丙醇提取時,維生素D2和維生素D3的回收率較大,但是維生素K1和維生素K2的回收率仍舊較小;以正己烷提取時,各目標(biāo)物均獲得較高的回收率,其中維生素K1和維生素K2的回收率顯著增大。綜合考慮回收率以及石油醚、乙醚、異丙醇在使用過程中對試驗人員健康影響較大等因素,試驗選擇的提取溶劑為正己烷。

2．4 電離模式的選擇

ESI+和大氣壓化學(xué)電離正離子(APCI+)模式都可用來電離脂溶性維生素[25]。為確定最優(yōu)電離模式,在20 μL·min-1流量下用蠕動泵進(jìn)樣10 ng各目標(biāo)物,分別用ESI+和APCI+模式電離。結(jié)果顯示,兩種電離模式下維生素A乙酸酯、維生素A棕櫚酸酯、維生素D2、維生素D3、DL-α-維生素E乙酸酯、維生素K1和維生素K2母離子質(zhì)譜響應(yīng)值比值分別為4.7,6.3,1.1,1.0,5.4,21.4,22.2,說明:對于維生素K1和維生素K2,ESI+模式比APCI+模式更靈敏;對于維生素D2和維生素D3,兩種模式電離效果基本一致;對于維生素A和維生素E,ESI+模式略優(yōu)。在實際檢測時,相關(guān)樣品中維生素A和維生素E含量較高,且APCI+模式電離后基線噪聲更低,兩種電離模式都可選用;但是維生素K1和K2含量相對較低,應(yīng)選擇靈敏度更高的ESI+模式。綜合考慮,試驗選擇的電離模式為ESI+。

2．5 色譜柱的選擇

試驗比較了HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、HSS C18色譜柱(100 mm×1.7 mm,1.8 μm)等3種色譜柱對7種目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果顯示,HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)所得各目標(biāo)物響應(yīng)值更高,分離度更好,峰形更尖銳,因此試驗選擇的色譜柱為HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。

在優(yōu)化的儀器工作條件下,各目標(biāo)物的定量離子色譜圖見圖3。

圖3 目標(biāo)物定量離子的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of quantitative ions of targets

2．6 工作曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示,維生素A乙酸酯、維生素A棕櫚酸酯、DL-α-維生素E乙酸酯的質(zhì)量濃度均在50～1 000 μg·L-1內(nèi),維生素D2、維生素D3、維生素K1和維生素K2的質(zhì)量濃度均在10～200 μg·L-1內(nèi)與各自對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,其他線性參數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab. 2 Linearity parameters, detection limits and lower limits of determination

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計算測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

2．7 精密度與回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進(jìn)行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)Tab. 3 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表3可知,各目標(biāo)物的回收率為83.4%～106%,測定值的RSD為1.9%～4.9%,滿足脂溶性維生素的實際檢測要求。

2．8 樣品分析

按照試驗方法分析一款顆粒型保健食品,該保健食品包含維生素A乙酸酯、維生素D3、DL-α-維生素E乙酸酯、維生素K1和維生素K2,標(biāo)簽值分別為4.0,0.2,50.0,0.5,1.8 μg·g-1。結(jié)果顯示,上述物質(zhì)的檢出量分別為4.83,0.225,58.6,0.593,2.05 μg·g-1,檢出量和標(biāo)簽值基本一致,略高于標(biāo)簽值。

本工作采用酶解法降解復(fù)雜基質(zhì)保健食品中的脂肪和蛋白質(zhì),正己烷提取7種脂溶性維生素營養(yǎng)補充劑,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定其含量。和傳統(tǒng)皂化法比較,方法操作簡單、檢測快速、有機試劑消耗量少、環(huán)境友好度高,具有一定的推廣價值。