王萍霞 鐘煌培 周芳芳

大腸埃希菌是腸桿菌科中埃希菌屬一個(gè)種類，也是人類以及動(dòng)物腸道中正常菌群主要成員，單克糞便當(dāng)中含有大腸桿菌大約109個(gè)[1]。大腸埃希菌廣泛分布在自然界的水、食品、土壤以及牛乳等中；因此，大腸埃希菌常作為衛(wèi)生監(jiān)督重要指示菌之一[2]。結(jié)合大腸埃希菌對(duì)于腸道的作用而言，能將其劃分成致病性、非致病性2 類。其血清分群采取O∶K∶H的方式表示，其中O抗原至今已經(jīng)有171種，屬于血清分型群重要基礎(chǔ)；K 抗原總共有99 種，H 抗原總共有60 種[3]。部分血清型對(duì)于腸道生理發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，是不可或缺的腸道內(nèi)部微生物，但另外一些血清型也能導(dǎo)致不同的特征性腹瀉以及腸道外感染，影響機(jī)體健康，需及時(shí)前往醫(yī)院就診，在必要情況下需合理采取抗菌治療[4]。微生物檢驗(yàn)屬于檢驗(yàn)大腸埃希菌的一項(xiàng)主要實(shí)驗(yàn)方法，有著較高準(zhǔn)確度，便于后續(xù)針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果用藥，防止抗生素濫用引起的治療無效等情況出現(xiàn)[5]。本研究現(xiàn)對(duì)2021年1—12月從泉州市鯉城區(qū)超市以及集貿(mào)攤點(diǎn)采集的100 份食品樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，分析大腸埃希菌微生物檢驗(yàn)方式以及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2021年1—12月從泉州市鯉城區(qū)超市以及集貿(mào)攤點(diǎn)采集的100 份食品樣本作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）檢驗(yàn)的食品樣本均來源于超市以及集貿(mào)攤點(diǎn)。（2）嚴(yán)格按照采集前預(yù)備、現(xiàn)場(chǎng)采集、樣品送檢、無法滿足檢驗(yàn)要求樣品的處理、采集工作結(jié)束各步驟進(jìn)行標(biāo)本采集。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）采集標(biāo)本期間出現(xiàn)污染者。（2）采集的標(biāo)本量不足者。食品標(biāo)本種類主要包含蔬菜類、海產(chǎn)類、鹵水、沙拉、燒烤等涼拌類、禽肉類、畜肉類共5 類，其中牲畜肉類18 份，生禽肉類20 份，涼拌類20 份，海產(chǎn)類20 份，蔬菜類22 份。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑

北京陸橋技術(shù)有限公司提供的改良大腸桿菌檢驗(yàn)（Escherichia colibroth，EC）肉湯、麥康凱培養(yǎng)基；法國(guó)科瑪嘉公司提供的O157 ∶H7 鑒定平板；廣州環(huán)凱公司提供的MH 平板；挪威Dynal 公司提供的免疫磁珠以及磁珠收集器；法國(guó)梅里埃公司提供的API-20E+鑒定卡；成都生物制品廠提供的大腸埃希菌鑒定血清；泰國(guó)S＆A 公司提供的O157 和H7 血清。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 大腸埃希菌檢測(cè) 對(duì)采集的所有樣本開展大腸埃希菌檢測(cè)工作，無菌操作采集樣品25 g，在EC 改良肉湯內(nèi)加入225 mL 樣品，培養(yǎng)18 ～24 h（37 ℃），在麥康凱改良平板內(nèi)接種，在37 ℃環(huán)境下進(jìn)行18 ～24 h 培養(yǎng)。挑選出可疑的菌落嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》[6]中方法開展相應(yīng)的檢測(cè)工作。另外免疫磁珠捕獲法根據(jù)食源性污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)工作制度完成大腸埃希菌中O157 ∶H7，同時(shí)予以鑒定血清學(xué)、生化實(shí)驗(yàn)學(xué)檢查。檢測(cè)的致瀉性大腸埃希菌株類型包含腸致病性大腸埃希菌（entero pathogenicEscherichia coli，EPEC）、產(chǎn)腸毒性大腸埃希菌（entero toxigenicEscherichia coli，ETEC）、腸出血性大腸埃希菌（entero hemorrhagicEscherichia coli，EHEC）、腸集聚性大腸桿菌（enteroaggregativeEscherichia coli，EAEC）、 腸侵襲性大腸埃希菌（entero invasiveEscherichia coli，EIEC）。

1.2.2.2 O157 ∶H7 毒力基因檢測(cè) 中國(guó)疾控中心傳染病防治研究所提供的O157、H7、eaeA、hly、SLT、SLT2序列引物。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。通過對(duì)H7/O157 抗原基因予以PCR 監(jiān)測(cè)，得到二者陽性菌株，后監(jiān)測(cè)毒力基因測(cè)定，包括SLT2、SLT、hly、eaeA。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間采取的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853 以及金葡菌ATCC25923，均為泉州市鯉城區(qū)疾病預(yù)防控制中心菌種庫負(fù)責(zé)保存。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)所有食品樣本中的致瀉性大腸埃希菌檢測(cè)結(jié)果以及致瀉性大腸埃希菌的毒力基因。比較不同食品樣本的大腸埃希菌檢出率差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 100 份檢測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果

100 份檢測(cè)樣本中，總共20 份檢出致瀉性大腸埃希菌，檢出率為20.00%（20/100）；其中包含ETEC 共6 株，占比為30.00%（6/20）；EPEC 共5 株，占比為25.00%（5/20）；EHEC 共5 株，占比為25.00%（5/20）；EIEC 共4 株，占比為20.00%（4/20）。牲畜肉類、生禽肉類、涼拌類、海產(chǎn)類以及蔬菜類食品的致瀉性大腸埃希菌檢出率依次為38.89%、45.00%、5.00%、10.00%、4.55%，其中牲畜肉類、生禽肉類的致瀉性大腸埃希菌檢出率高于涼拌類、海產(chǎn)類、蔬菜類等其他食品類型（P＜0.05）。見表1。

表1 不同食品樣本的大腸埃希菌檢出結(jié)果

2.2 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

分離的20 株致瀉性大腸埃希菌中，共有5 株EHEC的O157 ∶H7 鑒定血清凝集，其中在羊肉內(nèi)分離得到1 株O157 ∶H7 菌帶有eaeA、hly、SLT2毒力基因（見圖1），余下4 株O157 ∶H7 菌4 種毒力基因的eaeA、hly、SLT、SLT2均是陰性。

圖1 PCR 檢測(cè)的毒力基因電泳圖顯示帶有eaeA、hly、SLT2 毒力基因的O157 ∶H7 菌1 株

3 討論

大腸埃希菌是機(jī)體內(nèi)重要的單細(xì)胞生物，其周身存在鞭毛或者菌毛，能夠運(yùn)動(dòng)，且無芽[7]。大腸埃希菌不僅分布在機(jī)體與動(dòng)物腸道中，也廣泛分布在水源、牛乳、土壤和各種食物中，屬于水、食品大腸菌群重要的組成部分，結(jié)合大腸埃希菌數(shù)量能對(duì)糞便污染度給出重要判斷[8]。大腸埃希菌作為一類機(jī)會(huì)致病菌，盡管大多數(shù)的大腸埃希菌是無害的，但是有些也能致病，如致瀉性大腸桿菌能引起腹瀉和多個(gè)部位感染，且不同致瀉性大腸桿菌引起的感染癥狀各不相同，常見癥狀包括水樣便、腹痛、惡心、發(fā)熱、糞便中有少量黏液和血等，嬰幼兒多表現(xiàn)為2 周以上的持續(xù)性腹瀉同時(shí)耐藥性較強(qiáng)，已經(jīng)得到社會(huì)各界高度關(guān)注[9]。致瀉性大腸埃希菌在世界各地均為常見的食源性疾病暴發(fā)元兇，最近一次國(guó)際流行是發(fā)生在德國(guó)“黃瓜污染事件”（最終證實(shí)是芽菜污染），由大腸埃希氏菌O104 ∶H4 引起，波及9 個(gè)國(guó)家，約2 200 人生病，數(shù)10 人死亡[10]。

大腸埃希菌致病因素由于其外部的菌毛能附著黏膜表面細(xì)菌，這種作用能協(xié)助其定植，同時(shí)本菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，菌體內(nèi)有O 抗原、H 抗原和K 抗原等，其中K 抗原存在抗吞噬能力，并能對(duì)補(bǔ)體和抗體起到抵抗作用[11]。大腸埃希菌是革蘭陰性短桿菌，其性質(zhì)與其他種類的革蘭陰性菌引起肉毒素完全相同，同時(shí)和其生理以及病理作用類似，這些能使機(jī)體出現(xiàn)高熱、休克和彌散血管內(nèi)部凝血等癥狀[12]。除此之外，能生成以下2 類外毒素：其中1 類是耐熱性不佳的熱腸毒素，該類毒素于65 ℃環(huán)境下存在30 min 就能被破壞；第2 類是耐藥性較強(qiáng)熱腸毒素，該類毒素于100 ℃下維持20 min 不會(huì)被破壞。以上2 類毒素能使腸道分泌較多腸液，進(jìn)而引起腹瀉等疾病[13]。常見的致瀉性大腸埃希菌主要涉及EPEC、ETEC、EHEC、EAEC以及EIEC。本研究的100 份中，總共20 份檢出致瀉性大腸埃希菌，占比為20.00%；其中ETEC 占比為30.00%，EPEC 占比為25.00%；EHEC 占比為25.00%，EIEC 占比為20.00%。牲畜肉類、生禽肉類、涼拌類、海產(chǎn)類以及蔬菜類食品的致瀉性大腸埃希菌檢出率依次為38.89%、45.00%、5.00%、10.00%、4.55%，其中牲畜肉類、生禽肉類的致瀉性大腸埃希菌檢出率高于其他食品類型（P＜0.05）。說明需要食物衛(wèi)生監(jiān)督部門加大審查力度，指導(dǎo)其對(duì)家禽家畜類食物正確滅菌處理，對(duì)于肉類烹飪火候需要加大，防止食入生冷致病性食物。分離的20 株致瀉性大腸埃希菌中，共有5 株EHEC 的O157 ∶H7鑒定血清凝集，其中在羊肉內(nèi)分離得到1 株O157 ∶H7菌帶有eaeA、hly、SLT2毒力基因，該毒力菌株存在高致病性特征，這與有關(guān)報(bào)道中的大腸埃希菌有關(guān)毒力圖譜一致[14]；余下4 株O157 ∶H7 菌4 種毒力基因的eaeA、hly、SLT、SLT2均是陰性。上述結(jié)果說明，通過微生物檢驗(yàn)方法能有檢測(cè)到食品內(nèi)的大腸埃希菌及致瀉性大腸埃希菌有關(guān)毒力基因，需要高度重視食品安全衛(wèi)生問題，積極采取有效食品安全監(jiān)督管理措施，為人民群眾食品安全提供保障。筆者認(rèn)為，對(duì)于食品中的大腸埃希菌防控，需要從以下幾方面進(jìn)行：（1）對(duì)致病菌予以徹底高溫消毒是避免食物中毒的關(guān)鍵性手段。高溫（75 ℃）消殺肉類2 ～3 min，全部食物加溫高壓至75 ℃，可對(duì)大腸桿菌予以徹底消殺；熟食類長(zhǎng)期放置后需要再次高溫再入口；蒸煮禽蛋類食物需要達(dá)到8 ～10 min，蒸煮100 ℃。（2）對(duì)食物中繁殖致病菌予以有效阻斷，包括對(duì)儲(chǔ)存時(shí)間的縮短、低溫處理、分開熟食、生食、食品的低溫置存等。（3）避免食物被致病菌污染，增強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)督管理禽肉類生產(chǎn)企業(yè)，衛(wèi)生檢驗(yàn)屠宰前后的致病菌，加強(qiáng)置存食物的環(huán)境衛(wèi)生管理，防止在銷售、烹飪、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)生帶菌。

綜上所述，嚴(yán)格按照有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)開展微生物檢驗(yàn)?zāi)苡行z出食品中的大腸埃希菌和致瀉性大腸埃希菌毒力基因，需要加強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)督力度，確保食品安全，防范聚集性病例出現(xiàn)。此外，本研究中還有不足之處，如納入的樣本總數(shù)不多，未對(duì)微生物檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度、特異度和敏感度等指標(biāo)進(jìn)行分析，得到的結(jié)果還有局限性，這些均需在日后加以完善，更進(jìn)一步論證以上結(jié)果。