王思威, 王瀟楠, 常 虹, 劉艷萍

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點實驗室，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640)

香蕉和芒果是重要的熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物，但香蕉葉斑病和芒果炭疽病發(fā)生嚴(yán)重，是影響香蕉和芒果產(chǎn)量和質(zhì)量的重要病害，實際生產(chǎn)上多用三唑類殺菌劑進(jìn)行防治，傳統(tǒng)的三唑類殺菌劑因為抗性問題導(dǎo)致防治效果顯著下降。氯氟醚菌唑 (結(jié)構(gòu)式見圖式1) 是巴斯夫公司開發(fā)的第一個新型異丙醇三唑類殺菌劑，與現(xiàn)有三唑類菌劑相比，其作用機(jī)制獨(dú)特，具有保護(hù)、治療、鏟除作用，以及良好的環(huán)境相容性，不會對哺乳動物造成致畸性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、致癌性或內(nèi)分泌干擾等影響，屬于低風(fēng)險的三唑類殺菌劑。先后獲得歐盟、美國、澳洲等綠色、安全等級認(rèn)證，適用于大田作物、經(jīng)濟(jì)作物等 60 余種作物[1-3]。

圖式 1 氯氟醚菌唑結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of mefentrifluconazole

農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議 (JMPR) 規(guī)定其殘留物為氯氟醚菌唑，每日允許攝入量 (ADI) 為0.04 mg/(kg bw)，急性參考劑量 (ARfD) 為0.3 mg/(kg bw)。國際食品法典委員會(CAC)制定氯氟醚菌唑在香蕉、芒果上的最大殘留限量 (MRL) 分別為1.5 和0.6 mg/kg[4]。歐盟的評估結(jié)果為：氯氟醚菌唑的ADI為 0.035 mg/(kg bw)，ARfD 為0.15 mg/(kg bw)，制定其在香蕉、芒果上的MRL 值均為0.01 mg/kg[5]。目前氯氟醚菌唑在我國登記作物有蘋果、柑橘、芒果、香蕉、馬鈴薯、黃瓜和葡萄等[6]，但尚未制定氯氟醚菌唑在我國作物上的MRL 值[7]。

目前，關(guān)于氯氟醚菌唑殘留的研究相關(guān)報道較少，Zhang 等[8]開展了氯氟醚菌唑在稻米中的殘留消解動態(tài)和最終殘留量研究，并開展了急性和慢性風(fēng)險評估；Liu 等[9]闡明了S-氯氟醚菌唑和R-氯氟醚菌唑在西瓜中的選擇性降解、最終殘留量和儲藏穩(wěn)定性，并應(yīng)用概率模型進(jìn)行了膳食風(fēng)險評估；李艷紅[10]進(jìn)行了斑馬魚對氯氟醚菌唑?qū)τ丑w選擇性毒性效應(yīng)研究；Zhang[11]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，多壁碳納米管凈化，對6 種植物源樣品和5 種動物源樣品中的氯氟醚菌唑殘留進(jìn)行了檢測方法研究，并用該方法測定了田間黃瓜和番茄樣品；另有利用高效液相色譜分析氯氟醚菌唑制劑的報道[12]。目前尚未見采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (UPLC-MS/MS) 研究香蕉、芒果果實中氯氟醚菌唑殘留的報道。鑒于此，本研究擬建立氯氟醚菌唑在香蕉、芒果果實中殘留量的UPLC-MS/MS 檢測方法，并開展400 g/L 氯氟醚菌唑懸浮劑在香蕉、芒果中的消解動態(tài)、殘留分布特征研究，旨在為該藥在香蕉、芒果上的科學(xué)合理使用以及制定其MRL 值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥劑及主要儀器

98.7%氯氟醚菌唑 (mefentrifluconazole) 標(biāo)準(zhǔn)品，Chem Service 公司；400 g/L 氯氟醚菌唑懸浮劑 (mefentrifluconazole 400 g/L SC)，巴斯夫 (中國)有限公司；乙腈、甲醇 (色譜純，美國 Thermo Fisher Scientific 公司)；氯化鈉 (分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)；純凈水 (杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；N-丙基乙二胺吸附劑 (PSA，Agela Technology)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑 (C18，Agela Technology)；石墨化碳黑 (GCB，CNW Technology)。

LCMS-8045 超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀 (日本島津企業(yè)管理 (中國) 有限公司)；GTR22-1 離心機(jī) (北京時代北利離心機(jī)有限公司)；XW-80A 渦旋儀 (上海精科有限公司)；ULTRATURRAXT 25 勻漿機(jī) (德國IKA 公司)；HY-5 回旋式振蕩器 (天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)；FA2004分析天平、TXB622L 電子天平 (日本島津公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗 按照NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[13]于2018 年8—12 月分別在廣東廣州及茂名、廣西南寧、云南紅河、海南澄邁和福建漳州6 地開展了400 g/L 氯氟醚菌唑懸浮劑在香蕉上的殘留試驗；在廣東肇慶及茂名、廣西南寧、云南玉溪、海南三亞和福建漳州6 地開展了在芒果上的殘留試驗。其中殘留消解試驗在最終殘留試驗小區(qū)中開展，且不少于一半的點數(shù)開展消解試驗。每處理小區(qū)為4 棵樹，均重復(fù)1 次。另設(shè)對照小區(qū)。田間試驗設(shè)計詳見表1。施藥方式為電動噴霧器噴霧施藥。

表1 田間殘留試驗設(shè)計Table 1 Design of field trials for residue test

1.2.2 樣品采集與運(yùn)輸 根據(jù)田間試驗的采樣時間要求，隨機(jī)在試驗小區(qū)從4 株樹的不同方向及不同部位采集生長正常、無病害的個體，不少于12 個果實 (至少2 kg)，處理小區(qū)分別采集2 個獨(dú)立樣品。采集后8 h 立即制備成實驗室樣品，于-20 ℃保存，備用。

1.2.3 樣品制備 香蕉檢測全果、果肉樣品；芒果檢測去除果核后的整個果實和果肉，但全果的殘留量計算包括果核。

香蕉全果樣品：將香蕉果實表面上附著的雜質(zhì)與尾絲用干毛刷除去，剪去果柄。取1/2 計個數(shù)和稱量后，切碎，混勻，四分法縮分，分取150 g樣品兩份，于 -20 ℃貯存，待分析。

香蕉果肉樣品：取田間香蕉殘留樣本的另1/2 計個數(shù)和稱量后，剝?nèi)ハ憬镀ぃ〕龉?，切碎，混勻，四分法縮分，分取150 g 樣品兩份，于-20 ℃貯存，待分析。

芒果全果樣品：將芒果果實表面上附著的雜質(zhì)用干毛刷除去，剪去果柄。1/2 計個數(shù)和稱量后，取出果核，并稱重后，切碎，混勻，四分法縮分，分取150 g 樣品兩份，于 -20 ℃貯存，待分析。

芒果果肉樣品：取田間香蕉殘留樣本的另1/2 計個數(shù)和稱量后，剝?nèi)ッ⒐?，取出果肉，切碎，混勻，四分法縮分，分取150 g 樣品兩份，于-20 ℃貯存，待分析。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 稱取切碎樣品10 g (精確至0.1 g) 于100 mL 離心管中，加入20.0 mL 乙腈進(jìn)行提取，劇烈振蕩10 min，靜置30 min；加入1.0 g氯化鈉和4.0 g 無水硫酸鎂，渦旋1 min，于3000 r/min 下離心5 min；取1.5 mL 上清液，置于加有50 mg C18和10 mg GCB 的2 mL 離心管中，渦旋1 min，于10000 r/min 下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 濾膜，待UPLC-MS/MS 測定。

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜檢測條件 色譜條件：Shimpack GIST-HP C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm，3 μm)；柱箱溫度45 ℃；流動相為V(乙腈) :V(水) = 80 : 20；流速0.4 mL/ min；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；霧化氣流量2 L/min；加熱氣流量10 L/min；接口溫度350 ℃；DL 溫度100 ℃；加熱塊溫度400 ℃；干燥氣流量10 L/min；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。在此條件下，氯氟醚菌唑的保留時間為1.02 min。

表2 氯氟醚菌唑質(zhì)譜測定參數(shù)Table 2 MS parameters for the detection of mefentrifuconazole

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.1 mg)氯氟醚菌唑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于10 mL 容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)母液，再用乙腈逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.5、0.1、0.05、0.01 和0.005 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.2 節(jié)條件測定，外標(biāo)法定量，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(x) 為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別用芒果全果、芒果果肉、香蕉全果、香蕉果肉空白基質(zhì)對照液逐級稀釋上述氯氟醚菌唑標(biāo)準(zhǔn)母液，配制成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3.2 節(jié)的條件測定，以氯氟醚菌唑的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與檢測離子峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 添加回收試驗 準(zhǔn)確稱取空白香蕉全果、果肉樣品及芒果全果、果肉樣品，分別進(jìn)行0.001、0.01、0.1 和1.0 mg/kg 4 個水平氯氟醚菌唑的添加回收試驗，重復(fù)5 次。按1.3.1 節(jié)和1.3.2 節(jié)方法及條件進(jìn)行提取、凈化和測定，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 分別考察了乙腈、甲醇為提取溶劑對氯氟醚菌唑在香蕉和芒果中回收率的影響。結(jié)果 (圖1) 表明：以乙腈為提取溶劑時回收率為87%～96%，而以甲醇為提取溶劑時回收率低于70% (41%～67%)。按農(nóng)藥殘留回收率要求[13]，選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對氯氟醚菌唑提取效率的影響 (n = 3)Fig.1 Effect on extraction efficiency of extraction solvents for mefentrifuconazole (n = 3)

2.1.2 固相吸附劑種類及用量的選擇 分別比較了60 mg C18、60 mg GCB、50 mg C18+ 10 mg GCB、60 mg PSA 和50 mg PSA + 10 mg GCB 對芒果、香蕉基質(zhì)中氯氟醚菌唑殘留的凈化效果(n= 5)。結(jié)果 (圖2) 表明：60 mg GCB 凈化后的樣品中氯氟醚菌唑的回收率偏低 (64%～80%)，其他4 種凈化劑處理的樣品中氯氟醚菌唑的回收率均達(dá)到殘留試驗要求[13]，但60 mg C18和60 mg PSA 對樣品色素的吸附效果較差，50 mg C18+ 10 mg GCB 處理樣品的回收率又比50 mg PSA + 10mg GCB 的高，故最終選擇50 mg C18+ 10 mg GCB作為樣品前處理的凈化劑。

圖2 吸附劑對氯氟醚菌唑回收率的影響Fig.2 Effects of adsorbent combinations on the recoveries of mefentrifuconazole

2.2 色譜參數(shù)的選擇

在流速為0.4 mL/min 條件下，分別考察了以乙腈-水、乙腈-1%甲酸水溶液、甲醇-水和甲醇-1%甲酸水溶液作為流動相體系時對氯氟醚菌唑的響應(yīng)。結(jié)果 (圖3) 表明：以乙腈-水作為流動相時，氯氟醚菌唑的峰型最好，且響應(yīng)峰面積最大，故選擇乙腈-水為氯氟醚菌唑的流動相。然后，又考察了乙腈-水的不同體積配比對氯氟醚菌唑的響應(yīng)，結(jié)果表明：乙腈體積比例在65%～90%范圍內(nèi)，氯氟醚菌唑的響應(yīng)隨著乙腈體積比的增大而增大，綜合考慮保留時間和經(jīng)濟(jì)環(huán)保因素，最終選擇V(乙腈) :V(水) = 80 : 20。

圖3 流動相體系中氯氟醚菌唑的響應(yīng)強(qiáng)度 (體積比7 : 3)Fig.3 Response intensity of mefentrifuconazole in mobile phase system (V/V=7 : 3)

2.3 方法的線性方程、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

如表3 所示，氯氟醚菌唑的峰面積與質(zhì)量濃度間呈良好的線性關(guān)系?；|(zhì)效應(yīng)在-0.07%～5.86%，大于 -20%且小于20%，故基質(zhì)效應(yīng)可忽略，用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正[14]。氯氟醚菌唑在芒果和香蕉中的定量限 (LOQ) 均為0.001 mg/kg。

表3 氯氟醚菌唑線性方程及基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear equation and matrix effects of mefentrifuconazole

2.4 方法的正確度和精密度

從表4 中可看出：在0.001～1 mg/kg 4 個添加水平下，氯氟醚菌唑在香蕉果肉中的平均回收率和RSD 分別為84%～93%和2.3%～4.4%，在香蕉全果中的平均回收率和RSD 分別為83%～92%和3.4%～5.9%，在芒果果肉中的平均回收率和RSD分別為82%～89%和2.9%～5.1%，在芒果全果中的中的平均回收率和RSD 分別為85%～91%和3.1%～6.0%。方法的正確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析[13]的要求。典型色譜圖見圖4。

圖4 氯氟醚菌唑在香蕉和芒果果實中的典型圖譜Fig.4 Typical chromatograms of mefentrifuconazole spiked in banana and mango fruits

表4 氯氟醚菌唑在香蕉、芒果果實中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 5)Table 4 Average recovery, relative standard deviation of mefentrifuconazole in banana and mango fruits (n = 5)

2.5 氯氟醚菌唑在香蕉、芒果果實中的消解動態(tài)

400 g/L 氯氟醚菌唑SC 按有效成分133.3 mg/kg在香蕉施上噴霧施用3 次，在香蕉果實中的原始沉積量為0.19～0.51 mg/kg，施用7 d 后的消解速率為35.5%～74.5%；400 g/L 氯氟醚菌唑SC 按有效成分160 mg/kg 在芒果上噴霧施用3 次，在芒果果實中的原始沉積量為0.38～0.70 mg/kg，施用7 d 后的消解速率為35.9%～55.7%。

2.6 氯氟醚菌唑在香蕉、芒果果實中的最終殘留

結(jié)果(表5)表明：400 g/L 氯氟醚菌唑SC 按有效成分133.3 mg/kg 在香蕉上噴霧施用3 次，距末次施藥后21 和28 d，氯氟醚菌唑在香蕉全果中的殘留量分別為0.05～0.09 mg/kg 和0.03～0.06 mg/kg，而在香蕉果肉中分別為0.001～0.004 mg/k 和 ＜0.001～0.002 mg/kg。400 g/L 氯氟醚菌唑SC 按有效成分160 mg/kg 在芒果上噴霧施用3 次，距末次施藥后14 和21 d，氯氟醚菌唑在芒果全果中的殘留量分別為0.12～0.28 mg/kg 和0.04～0.16 mg/kg，在芒果果肉中分別為0.001～0.003 mg/kg 和0.001～0.002 mg/kg。

表5 氯氟醚菌唑在香蕉、芒果中的最終殘留量Table 5 The terminal residues of mefentrifuconazole in banana and mango fruits

氯氟醚菌唑在香蕉、芒果中的殘留量伴隨施藥時間的延長呈現(xiàn)明顯下降趨勢。香蕉果肉的質(zhì)量占全果比例約為60%，芒果果肉質(zhì)量占全果60%～80%，氯氟醚菌唑的辛醇-水分配系數(shù)(Kow)分為3.4，屬于中等強(qiáng)度移動性的親脂性農(nóng)藥[15]，易于附著在含臘質(zhì)的果皮上。以上因素決定了氯氟醚菌唑主要?dú)埓嬖谙憬逗兔⒐ぶ小?/p>

3 結(jié)論與討論

本研究對香蕉、芒果樣品中氯氟醚菌唑的前處理條件和儀器分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了以乙腈為提取溶劑，以C18和GCB 為凈化劑，采用UPLC-MS/MS 檢測香蕉和芒果中氯氟醚菌唑的消解動態(tài)和殘留的分析方法。結(jié)果表明，氯氟醚菌唑在香蕉和芒果中的殘留量與作物種類、田間氣候條件等因素相關(guān)；隨施藥間隔天數(shù)增加，殘留量降低。氯氟醚菌唑在果肉中的殘留量低于全果，這與氯氟醚菌唑的辛醇水分配系數(shù)、水溶性等因素相關(guān)。馬晨等[16-17]研究芒果、香蕉果實中農(nóng)藥殘留分布結(jié)果表明，農(nóng)藥在全果中的殘留量高于在果肉中的，對于內(nèi)吸性較強(qiáng)的農(nóng)藥，少部分樣品中果肉中的殘留量高于全果或只在果肉中有檢出。

農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制定事關(guān)保障消費(fèi)者身體健康、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、促進(jìn)食品和農(nóng)產(chǎn)品公平貿(mào)易，各個國家及組織均對其非常重視。JMPR依據(jù)來自厄瓜多爾良好農(nóng)業(yè)規(guī)范 (Good Agricultural Practices，GAP)，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)來自巴西、哥倫比亞和厄瓜多爾，按有效成分140 g/hm2，間隔14 d，施用5 次，一季總用量700 g/hm2，采收間隔期0 d，具體的殘留試驗數(shù)據(jù)為：全果0.04、0.12、0.16、0.24、0.35、0.47、0.54、0.57、0.65、0.74 mg/kg，果肉 ＜ 0.01、0.01、0.04、0.05(2)、0.06、0.09、0.14、0.21(2) mg/kg，制定其在香蕉 (全果) 中的MRL 值為1.5 mg/kg[18]。JMPR 制定氯氟醚菌唑在芒果中的MRL 值時，其GAP 來自中國，按0.016 kg a.i/hL，間隔10 d，安全間隔期 (pre-harvest interval, PHI) 14 d，施用3 次，全果上殘留數(shù)據(jù)為0.12、0.16 (2)、0.20、0.22、0.28 mg/kg[18]，制定芒果上的MRL 值為0.6 mg/kg[18]。本研究中采用的GAP 及結(jié)果與之一致。

比較本試驗數(shù)據(jù)與JMPR 制定香蕉MRL 值的數(shù)據(jù)，GAP 不同，存在較大差異，具體在用藥量、次數(shù)、間隔期等方面均不同，與戊唑醇、丙環(huán)唑的研究結(jié)果一致[19]。導(dǎo)致我國部分農(nóng)藥在香蕉中的MRL 值與CAC 限量存在差異的另外一個原因，可能與噴霧器械、施用方式有關(guān)，例如JMPR 制定香蕉中吡唑醚菌酯MRL 值的GAP 來自中、南美州[20]，噴液量為21～28 L/hm2，推測可能用飛防方式進(jìn)行試驗，而我國通常的噴液量為900 L/hm2，以背負(fù)式噴霧器、大體積噴淋為主。第3 個原因是國際上對于香蕉上MRL 值制定的適用部位不同：CXG41—1993《關(guān)于適用MRLs 并分析的商品部位指南》和CXA-4—1989《食品和飼料分類》，有基于果肉的，也有基于全果的，造成混亂。例如，吡唑醚菌酯在JMPR 報告中的測定部位是全蕉[20]，丙環(huán)唑在報告[21]中的測定部位是果肉、果皮，然后按果皮占全果的30%折算得到全果的殘留量，而腈苯唑在報告[22]中的測定部位是果肉、果皮、全果。

目前我國尚未制定氯氟醚菌唑在任何食品上的MRL 值，本研究明確了氯氟醚菌唑在香蕉和芒果上的消解動態(tài)和最終殘留量水平，可為該農(nóng)藥在我國相關(guān)作物上登記使用提供基礎(chǔ)評價數(shù)據(jù)。