劉曉娟, 鄧培淵, 范春麗, 田云芳

(鄭州師范學院 鄭州市植物景觀多樣性與生態(tài)修復重點實驗室，鄭州 450044)

環(huán)氧蟲啶(cycloxaprid)是華東理工大學開發(fā)的一個具有自主知識產權的新煙堿類殺蟲劑[1]。在商品化新煙堿類殺蟲劑的結構中，吡蟲啉等常見殺蟲劑的硝基均為反式構型，而環(huán)氧蟲啶是獨特的順式硝基構型并含有七元氧橋雜環(huán)結構 (結構式見圖式1)，因此環(huán)氧蟲啶的作用機制與其他新煙堿類不同，其對抗性害蟲的殺蟲活性優(yōu)于吡蟲啉，具有廣闊的應用前景[2]。

圖式 1 環(huán)氧蟲啶結構式Scheme 1 The structural formula of cycloxaprid

由于新煙堿類殺蟲劑對昆蟲煙堿乙酰膽堿受體具有較高選擇性，所以被認為其對非靶標生物低毒[3]。但有研究表明，新煙堿類殺蟲劑對非靶標生物也具有危害性，主要表現(xiàn)為氧化應激、抑制活動能力、損傷DNA 和生育功能受損等[3-4]。此外，由于該類殺蟲劑的大量使用，導致土壤、水體、空氣等被污染，而人體通過飲食、飲水、呼吸等多種途徑會暴露于該類農藥中[5]，因此其對人類的生育、生殖、神經以及臟器功能也帶來風險[6-7]。

目前，有關環(huán)氧蟲啶的研究，在毒理學、作用方式、代謝與殘留等方面取得了一定的進展[8]，但其對人體的影響、毒性機理以及在人體內的運輸機制尚缺乏進一步研究。人血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 是人血漿中含量最豐富的非特異性載體蛋白質，具有多種生理功能[9]。藥物進入人體血液系統(tǒng)后，大部分先與HSA 進行可逆結合，然后進行存儲、轉運、發(fā)揮藥效或毒副作用。藥物與HSA 可逆結合的親和性，直接影響了藥物分子在血液中的生物利用率、分布、自由態(tài)濃度和代謝[10]。此外，HSA 還是研究藥物與蛋白質結合機制的經典模型蛋白，常被用于藥物與蛋白質相互作用的研究中[11-12]。因此，在分子水平研究環(huán)氧蟲啶與HSA 的相互作用，對環(huán)氧蟲啶的毒理學及其安全風險評估具有較大的借鑒意義。

當藥物與蛋白質結合時，蛋白質的二維和三維結構均會發(fā)生改變，進而影響蛋白質的生理功能[13]。熒光光譜法是研究蛋白質分子構象的一種有效方法，可以推斷蛋白質分子在各種環(huán)境下的構象變化，進而闡釋蛋白質結構與功能間的關系[14]。分子對接是通過計算機建立小分子配體與蛋白質的受體結構，模擬二者結合中發(fā)生的分子行為與結構變化[15]，是研究分子間相互作用的重要方法之一。分子動力學可以從分子水平來研究藥物靶點蛋白的結構[16]，為研究蛋白質的力學行為、蛋白質動態(tài)的相互作用和生物網絡分析提供了新視角和新途徑[17]。熒光光譜法、分子對接技術及分子動力學模擬三者常常結合使用，用于對實驗結果的進一步驗證[18-21]。鑒于此，本研究運用熒光光譜法、分子對接技術及分子動力學模擬相結合來研究環(huán)氧蟲啶與HSA 結合的特性和機理。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

F-380 型熒光分光光度計 (天津港東科技發(fā)展有限公司)，YASARA 分子模擬工作站 (奧地利格拉茲大學)。環(huán)氧蟲啶(cycloxaprid，99.5%標準品，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)，人血清白蛋白(HSA)、華法林 (warfarin) 和布洛芬 (ibuprofen)(北京索萊寶科技有限公司)。其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 熒光猝滅實驗 添加1.0 × 10-4mol/L 的環(huán)氧蟲啶甲醇溶液于1.0 × 10-6mol/L 的HSA 溶液中(HSA 溶于PBS 緩沖液，pH = 7.4，含質量分數為0.9%的NaCl)，使環(huán)氧蟲啶的終濃度分別為HSA濃度的0、1、2、4、6、8、10 倍；激發(fā)波長λex=280 nm，狹縫寬度為10/5 nm，發(fā)射波長在290～450 nm，分別設置溫度為293、302 和310 K，掃描HSA 與環(huán)氧蟲啶作用的熒光光譜。

1.2.2 位點競爭實驗 位點標記物華法林和布洛芬分別代表HSA 結構的siteI 和siteⅡ位點，環(huán)氧蟲啶和HSA 濃度比為4 : 1，向其中加入位點標記物進行滴定實驗。其他實驗方法與1.2.1 節(jié)相同，計算在310 K 時HSA 和環(huán)氧蟲啶的結合常數和結合位點數。

1.2.3 分子對接 通過分子對接可以將配體與受體迅速結合，從而獲取配體和受體之間相互作用信息，實現(xiàn)對分子間結合位點和結合作用力的預測[22]。從Protein Data Bank 中下載HSA 晶體結構(2BX8)，運用YASARA 程序完成原始結構的加H、除H2O 和添加缺失原子[23]；參考1.2.2 節(jié)中確定的環(huán)氧蟲啶結合位點，運用AutoDock4.0 進行剛性對接，設置環(huán)氧蟲啶為全柔性結構，其他參數均為默認值。

1.2.4 分子動力學模擬 分子動力學模擬在YASARA 平臺完成。體系置于TIP3P 顯性立方體H2O 分子模型中，原子與邊界之間的距離為0.9 nm，采用Amber14 力場，添加鈉離子保持體系電中性。模擬設置pH = 7.4 和溫度310 K，采用NVT正則系宗和郎格萬方法控制體系溫度，積分步長為2.5 fs，采樣間隔為50 ps。程序在Centos 系統(tǒng)下運行。

1.2.5 結合自由能計算 運用Amber12 程序包MMPBSA.py 模塊中的MM-PBSA[24]方法計算環(huán)氧蟲啶和HSA 的結合自由能，對模擬平衡后5 ns動力學軌跡的100 個構象進行采樣分析，結合自由能 (ΔG) 和范德華力 (ΔEvdw)、靜電作用力 (ΔEele)、非極性溶劑化能 (ΔGnopolar) 和極性溶劑化能 (ΔGpb)間的關系如公式 (1) 所示：

1.2.6 能量分解和丙氨酸突變掃描 運用Amber14軟件包，分解對接復合物中HSA 單個氨基酸能量貢獻。為評估單個氨基酸能量貢獻值的分布特征，對貢獻值較高 (大于2.09 kJ/mol) 的氨基酸進行丙氨酸突變掃描計算[25]，比較突變前結合自由能(ΔGwild)和突變后結合自由能(ΔGmutant)的差值(ΔΔG)。

2 結果與分析

2.1 熒光猝滅機制

在模擬人體生理的條件下，測試了不同濃度的環(huán)氧蟲啶加入HSA 混合液的熒光光譜。結果(圖1) 表明，HSA 的內源熒光發(fā)射峰位于334 nm處，隨著環(huán)氧蟲啶的加入，HSA 的熒光強度逐漸降低，峰值有微弱藍移，表明環(huán)氧蟲啶使HSA 的色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化[25]，環(huán)氧蟲啶能有效地猝滅HSA。

圖1 不同濃度環(huán)氧蟲啶時HSA 的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Emission spectra of human serum albumin in the presence of various concentrations of cycloxaprid

判斷體系的熒光猝滅機制時，可按照Stern-Volmer 方程 (2)[26]進行分析。

式中：F0和F分別表示沒有和有環(huán)氧蟲啶時HSA 的熒光強度；Ksv為動態(tài)猝滅常數；[Q]為環(huán)氧蟲啶濃度；Kq為猝滅速率常數；τ0為HSA 的分子平均壽命10-8s。計算的猝滅常數 (表1) 顯示，HSA 和環(huán)氧蟲啶的Ksv的值隨著溫度的升高而減小，說明HSA 和環(huán)氧蟲啶的作用為靜態(tài)猝滅，Kq值遠大于生物大分子的最大碰撞碎滅常數(2.0 ×1010L/(mol·s))[26]，說明HSA 與環(huán)氧蟲啶有較強的親和力，環(huán)氧蟲啶與HSA 結合利于其到達特定組織和持續(xù)發(fā)揮作用。

表1 不同溫度下環(huán)氧蟲啶和HSA 相互作用的猝滅常數(Ksv)、猝滅速率常數(Kq)Table 1 The quenching constants (Ksv), quenching rate constants (Kq) of the interaction of cycloxapyrid with HSA at different temperatures

2.2 結合常數和結合位點數

HSA 和環(huán)氧蟲啶的結合為靜態(tài)猝滅過程，KA為結合常數，n為結合位點數，按照公式(3)計算得到不同溫度下HSA 和環(huán)氧蟲啶結合常數在0.76 × 105～1.57 × 105L/mol 之間，表明兩者有較強的結合能力；結合位點數位于0.89～0.98 之間，說明兩者有1 個結合位點 (表2) 。

表2 不同溫度下環(huán)氧蟲啶與HSA 作用的結合常數 (KA) 和結合位點數 (n)Table 2 The binding constants (KA) and binding sites (n)of the cycloxapyrid with HSA at different temperatures

2.3 環(huán)氧蟲啶結合位點的確定

藥物與蛋白之間的相互作用通常是多種作用力的協(xié)同作用，這種相互作用的量化參數就是藥物與蛋白的結合常數KA。結合常數越小，表明外源物對位點探針的替代性越強，即競爭性越強。

HSA 的兩個主要結合位點siteI 和siteII，分別位于HSAIIA 和IIIA 的疏水腔內。研究表明，華法林與HSA 結合在siteI 位點，布洛芬結合在siteII 位點[27]。本研究結果 (表3) 顯示，與空白對照比對，添加華法林后環(huán)氧蟲啶與HSA 的結合常數發(fā)生了明顯的變化，說明環(huán)氧蟲啶法與華法林競爭同一結合位點，即環(huán)氧蟲啶結合在了HSA IIA 疏水腔內的siteI 位點。

表3 位點標記物對結合體系結合常數的影響Table 3 Effect of site maker probes on binding constants of binding system

2.4 熱力學參數和作用力類型

蛋白質與小分子借助氫鍵、靜電作用力、范德華力和疏水作用力等非共價結合形成復合物，其作用力類型可以根據熱力學常數大小判斷，通過Van't Hoff 方程[28](公式4 和5) 計算自由能變(ΔG)、焓變 (ΔH) 和熵變 (ΔS)。

不同溫度條件下環(huán)氧蟲啶與HSA 相互作用的熱力學參數測定結果 (表4) 表明：不同溫度下，ΔG均小于0，表明兩者的結合是自發(fā)反應；ΔH和ΔS均小于0，根據Ross 等[29]提出的理論分析，環(huán)氧蟲啶和HSA 結合過程的主要作用力是范德華力和氫鍵作用。

表4 不同溫度下環(huán)氧蟲啶和HSA 相互作用的熱力學參數Table 4 Thermodynamic parameters for the interaction of the cycloxapyrid with HSA at different temperatures

2.5 分子對接結果

參考2.3 節(jié)中預測的環(huán)氧蟲啶與HSA 的結合位點，將其固定于HSA 的siteI 位點，設置Grid Box 涵蓋整個模型，對接體系格點為110 × 98 × 105，間距為0.375 ? (1 ? = 0.1 nm)，最優(yōu)結合模式如圖2 所示，環(huán)氧蟲啶與His416 和Gln459 形成了兩個鍵長分別為4.13 ?和5.89 ?的氫鍵，說明氫鍵是兩者結合的分子基礎，這與熱力學參數顯示的結果是一致的。

圖2 環(huán)氧蟲啶與HSA 的結合方式Fig.2 Binding mode of cycloxapyrid and HSA

2.6 分子動力學模擬結果

本研究采用分子動力學對分子對接的結果進行驗證。均方根偏差 (root mean square deviation，RMSD) 是判斷體系是否達到平衡狀態(tài)的重要指標之一。由圖3、圖4 可知，HSA 和環(huán)氧蟲啶復合物體系中，在約25 ns 達到收斂平衡狀態(tài)，主鏈原子的RMSD 在2.0 ?左右波動，說明兩者可以形成穩(wěn)定復合物；與HSA 單體的分子動力學模擬結果相比，復合物體系更容易達到平衡態(tài)，且RMSD值更低，說明HSA 中加入環(huán)氧蟲啶后，體系更加穩(wěn)定，進一步證明了兩者的結合可以自發(fā)進行。

圖3 分子動力學模擬中主鏈原子均方根偏差的變化Fig.3 The change of RMSD of backbone atoms in molecular dynamics simulation

圖4 分子動力學模擬體系能量變化Fig.4 The change of system energy in molecular dynamics simulation

2.7 結合自由能的計算結果

運用Amber12 程序包MMPBSA.py 模塊中的MM-PBSA 方法，計算得到環(huán)氧蟲啶與HSA 自由能為 -25.90 kJ/mol (表5)，兩者形成了相對穩(wěn)定的復合物。對結合自由能進行分析發(fā)現(xiàn)，范德華力、靜電作用力和非極性溶劑化能可促進兩者的結合，能量貢獻值分別為 -77.95、-23.81 和 -12.30 kJ/mol，其中范德華力是主要驅動力；極性溶劑化能是主要的抑制力，能量貢獻值為85.81 kJ/mol。

表5 環(huán)氧蟲啶和HSA 復合物結合自由能和組分Table 5 The binding free energy and components of cycloxapyrid and HSA complex (kJ/mol)

2.8 氨基酸殘基能量分解結果

為研究HSA 單個氨基酸殘基在結合過程中的能量貢獻及分布，運用Amber12 程序分析了單個氨基酸的總能量和側鏈能量，結果見表6。共有6 個氨基酸的能量貢獻值超過6 kJ/mol，包括Ala194、Leu198、Val455、Asn458、Gln459 和Val462，氨基酸Gln459 貢獻值差最大，為11.22 kJ/mol。這些氨基酸殘基集中在Gln459 附近，表明該區(qū)域是環(huán)氧蟲啶和HSA 結合的關鍵區(qū)域。

表6 環(huán)氧蟲啶和HSA 復合物殘基能量分解能量分項值Table 6 The energy decomposition on a per-residue of cycloxapyrid and HSA complex (kJ/mol)

2.9 丙氨酸突變掃描結果

單個氨基酸殘基的能量貢獻值，包括殘基之間的相互作用和殘基與外源分子的作用[30]。為了探究氨基酸殘基對外源分子結合的影響，假設受體和配體的結合模式不受局部構象變化的影響，選取Ala194、Leu198、Val455、Asn458、Gln459 和Val462 氨基酸突變體進行掃描。

丙氨酸突變掃描是為了進一步分辨出氨基酸殘基能量分解后自由能較高的氨基酸。掃描結果顯示，只有Asn458 和Gln459兩個氨基酸突變體具有較明顯的結合自由能 (表7)，結合自由能差分別為 -7.40 和 -10.42 kJ/mol，表明Gln459 是與外源分子環(huán)氧蟲啶結合的關鍵氨基酸，這也是對氨基酸殘基能量分解結果的進一步驗證。

表7 環(huán)氧蟲啶和HSA 結合突變體的結合自由能Table 7 The binding free energies of mutant complex of cycloxapyrid and HSA (kJ/mol)

3 結論與討論

本研究探討了環(huán)氧蟲啶與人血清蛋白的相互作用。分別采用熒光猝滅法、分子對接和分子動力學等方法進行了多方面的實驗與驗證。熒光猝滅是指熒光分子與溶劑分子之間發(fā)生猝滅，多用于生物大分子和小分子藥物或者金屬離子之間的相互作用[31]。借助于熒光猝滅法，獲得環(huán)氧蟲啶與HSA 的結合常數在0.76 × 105～1.57 × 105L/mol之間，二者結合在HSA IIA 疏水腔內的siteI 位點。分子對接時，以結構生物學為基礎進行環(huán)氧蟲啶與HSA 相互作用的動力學模擬研究，確定環(huán)氧蟲啶與HSA 的作用靶點，得到HSA 與環(huán)氧蟲啶的結合自由能為 -25.90 kJ/mol，表明二者可以形成穩(wěn)定的復合物。農藥與蛋白質的有效結合，可以直接影響藥物在人體內的擴散[32]。本研究表明，環(huán)氧蟲啶在人體內可能具有較強的擴散能力。

HSA 含有3 個晶體結構域[33]，每個結構域都有A、B 兩個亞結構。大多數化學合成物與HSA結合在IIA 和IIIA 部位，其中IIIA 的活性最強[34]。本研究結果表明，HSA 與環(huán)氧蟲啶結合的主要能量貢獻殘基集中位于IIA 區(qū)域，不在活性最高的IIIA 區(qū)，這與華法林與HSA 的結合模式一致[35]。這可能是由于IIA 位于α-螺旋形成的通道底部，更有利于環(huán)氧蟲啶的結合與釋放，也表明HSA 與外源小分子的結合模式可能是多因素共同作用的結果。

Moreira 等[36]將突變體掃描中氨基酸ΔΔG能量的不同分為：“hot spots (熱點)”“warm spots (暖點)”和“null spots (非點)”。本研究中，Gln459為近似暖點，是環(huán)氧蟲啶與HSA 結合的關鍵氨基酸，對環(huán)氧蟲啶在人體內的吸收、轉運和降解過程中起重要作用。本研究為環(huán)氧蟲啶在人體內的運轉機理提供了一定的依據，也可為開發(fā)新型更加環(huán)保、低毒的殺蟲劑提供借鑒。