林玉霞, 鞏月紅, 朱莉娜, 趙美玲, 潘美馳, 趙一聰, 王建華

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 烏魯木齊 830011; 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830054)

囊型包蟲病(Cystic Echinococcosis, CE)是由細(xì)粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)引起的人畜共患寄生蟲疾病,在我國新疆、青海、寧夏等地為囊型包蟲病高發(fā)區(qū),該病流行區(qū)人群平均患病率為1.08%[1]。目前WHO推薦的治療CE的藥物為阿苯達(dá)唑,但該藥物吸收性差、治愈率低、復(fù)發(fā)率較高[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)多年生草本蒺藜科植物駱駝蓬種子提取物中的去氫駱駝蓬堿(Harmine, HM)具有良好的抗包蟲療效,但因其具有神經(jīng)系統(tǒng)毒性一直未應(yīng)用于臨床[3]。因此明確HM及其衍生物的抗囊型包蟲作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)是提高藥物療效的關(guān)鍵。TP53為核糖核酸結(jié)合蛋白家族中一種腫瘤抑制蛋白,在大多數(shù)人體腫瘤組織中都能觀察到TP53突變或失活[4-5]。TP53是一個(gè)巨大蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中心,允許多種信號整合,當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷時(shí),會導(dǎo)致該網(wǎng)絡(luò)的激活,激活后TP53結(jié)合啟動子區(qū)域的特定DNA共識序列,刺激相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)誘導(dǎo)DNA修復(fù)機(jī)制,如果修復(fù)不成功,則誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡[6-8]。TP53在DNA損傷通路中的關(guān)鍵作用,成為藥物和疫苗開發(fā)的熱點(diǎn)。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對細(xì)粒棘球蚴中TP53(EgTP53)的蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析,檢測HM對EgTP53蛋白表達(dá)的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)粒棘球蚴收集從綿羊的肝臟包囊中采集細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié),用含有2%青鏈霉素(雙抗)的無菌生理鹽水進(jìn)行沖洗,添加RPMI1640培養(yǎng)基,得到含有原頭蚴的混懸液,其中原頭蚴的活性維持在95%以上。

1.2 儀器與試劑胎牛血清(美國Gibco公司),青鏈霉素(美國 Hyclone公司),總RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara生物技術(shù)有限公司),Trizol試劑(美國Invitrogen公司),PCR反應(yīng)試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),HM(新疆華世丹藥物研究所),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Fisher scientific公司),細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher scientific公司)。

1.3 HM與EgTP53蛋白分子對接驗(yàn)證采用TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) 數(shù)據(jù)庫獲取HM的MOL2格式文件,從PDB( https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索EgTP53蛋白的3D結(jié)構(gòu),使用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對接,獲得相互作用中結(jié)合能最低的模型,將其模型經(jīng)Pymol軟件進(jìn)行可視化處理。當(dāng)對接能量小于0時(shí),認(rèn)為配體與受體之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。

1.4 EgTP53蛋白的生物信息學(xué)分析

1.4.1 EgTP53蛋白理化性質(zhì)預(yù)測及親疏水性分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得登錄號Gene ID:3633851,通過Protparam蛋白分析工具(http://web.expasy.org/protparam/)對EgTP53蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。當(dāng)不穩(wěn)定指數(shù)大于40時(shí),蛋白質(zhì)被認(rèn)為是相對不穩(wěn)定的[8]。通過生信在線軟件工具ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)評估EgTP53蛋白親疏水性,平均疏水指數(shù)正值表示相對疏水性,負(fù)值表示相對親水性。

1.4.2 EgTP53蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測與信號肽分析 采用SignalP5.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對EgTP53蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測,以確定其是否含有信號肽序列。通過生物學(xué)在線軟件工具TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析EgTP53蛋白存在的跨膜區(qū)域。

1.4.3 EgTP53蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析 使用SOPMA在線軟件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析EgTP53蛋白二級結(jié)構(gòu)和可溶性區(qū)域預(yù)測。使用SWISS-MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy.org/)對EgTP53蛋白進(jìn)行同源建模,預(yù)測EgTP53蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.4.4 預(yù)測EgTP53蛋白磷酸化位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域 使用在線軟件NetPhos 3.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)預(yù)測EgTP53蛋白存在的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。通過Conserved Domain Database(CDD)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)分析EgTP53蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.4.5 EgTP53B細(xì)胞抗原表位的測定 使用IEDB在線軟件(https://www.iedb.org/)分析EgTP53蛋白B細(xì)胞抗原表位,得出易形成抗原表位的區(qū)域。

1.4.6 EgTP53蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 登錄NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,獲得不同種屬EgTP53蛋白的氨基酸序列,使用MEGA6.0軟件對EgTP53蛋白和其他物種的TP53蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行分析。

1.5 去氫駱駝蓬堿對EgTP53蛋白表達(dá)檢測取“1.1”項(xiàng)下的細(xì)粒棘球蚴,隨機(jī)分為3組,每組3份,按照密度3 000頭/孔分別加入24孔培養(yǎng)板中,分別加PBS緩沖液,1% DMSO,100 μmol/L HM干預(yù)24 h,收集細(xì)粒棘球蚴樣本,用PBS清洗,采用Trizol溶液提取各樣本總RNA,將RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,按Takara試劑盒說明書方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,引物信息見表1。準(zhǔn)備模板DNA、配置PCR反應(yīng)液、進(jìn)行PCR反應(yīng),測定各組的EgTP53蛋白mRNA 表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用2-△△Ct方法計(jì)算各組EgTP53蛋白的相對表達(dá)水平。

表1 EgTP53蛋白及內(nèi)參引物信息

2 結(jié)果

2.1 EgTP53蛋白與HM的對接結(jié)果使用AutoDock Vina 軟件對EgTP53蛋白與HM進(jìn)行分子對接,結(jié)果顯示結(jié)合能為-4.44 kcal/mol。對接結(jié)果模型運(yùn)用Pymol軟件進(jìn)行可視化,對接結(jié)果顯示HM與EgTP53蛋白有較好的結(jié)合,見圖1。

圖1 EgTP53蛋白與HM的分子對接位點(diǎn)圖

2.2 EgTP53蛋白的理化性質(zhì)及親疏水性分析EgTP53蛋白的相對分子量:121 799.11,等電點(diǎn):9.29,氨基酸數(shù)量1 108,帶正電殘基:139,帶負(fù)電殘基:118,原子總數(shù):17 183。不穩(wěn)定指數(shù):59.19,表明EgTP53蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù):82.17。含有多個(gè)親水性較高的區(qū)域,其平均疏水指數(shù)為-0.347,判斷EgTP53g蛋白屬于親水性蛋白,見圖2。

(注: 正值表示疏水性,負(fù)值表示親水性)

2.3 EgTP53蛋白信號肽與跨膜區(qū)域經(jīng)Netphos3.1在線軟件預(yù)測EgTP53蛋白的信號肽Sec/SPI:0.000 6,無信號肽裂解位點(diǎn)和跨膜區(qū)域,見圖3。表明EgTP53蛋白為非分泌性、非膜質(zhì)的蛋白,在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)或者參與信號傳導(dǎo)等重要功能。

圖3 EgTP53蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測圖

2.4 EgTP53蛋白的磷酸化位點(diǎn)及結(jié)合域EgTP53蛋白有105個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn), 63個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),7個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),見圖4。通過CDD數(shù)據(jù)庫分析EgTP53蛋白的結(jié)構(gòu)域中存在TUDOR蛋白結(jié)構(gòu)域,位于第391至441個(gè)氨基酸之間;存在2個(gè)BRCT保守蛋白結(jié)構(gòu)域,一個(gè)位于第824至907個(gè)氨基酸之間,另一個(gè)位于第1 037至1 095個(gè)氨基酸之間,見圖5。

圖4 EgTP53蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測圖

圖5 EgTP53蛋白結(jié)構(gòu)域圖

2.5 EgTP53蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析采用SOMPA平臺分析 EgTP53蛋白二級結(jié)構(gòu):α螺旋占30.05%,β折疊占17.51%,β轉(zhuǎn)角占4.69%,無規(guī)則卷曲占47.75%,見圖6。運(yùn)用SWISSMODEL在線程序構(gòu)建的EgTP53蛋白三級結(jié)構(gòu)見圖7,與模板序列同源性為99.91%,GMQE 得分為0.50。

圖6 EgTP53蛋白的二級結(jié)構(gòu)圖

圖7 EgTP53蛋白三級結(jié)構(gòu)圖

2.6 EgTP53蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測IEDB在線預(yù)測軟件預(yù)測EgTP53蛋白主要的細(xì)胞抗原表位在:5-36、42-61、67-99、101-124、133-146、151-224、227-227、229-251、261-295、320-387、401-417、423-432、442-484、494-499、505-667、682-787、797-823、838-868、891-896、912-921、931-936、949-969、975-981、988-991、1003-1008、1021-1055、1064-1080、1096-1105位置存在氨基酸。

2.7 EgTP53的系統(tǒng)進(jìn)化通過MEGA6.0軟件構(gòu)建TP53系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析不同種屬TP53之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,見圖8。EgTP53蛋白具有多個(gè)分支,EgTP53蛋白與亞洲帶絳蟲病(VDK41028.1:28-1014)、帶狀泡尾絳蟲(VDM33434.1:1-1099)同屬一個(gè)分支,相似性接近83%,與長膜帶絳蟲(VUZ428752.1:95-732)、矮小齒殼絳蟲(VDN96517.1:131-750)、微口膜殼絳蟲(CDS26543.1:788-1424)同屬絳蟲綱,進(jìn)化關(guān)系較近,相似性接近78%,與人親緣性較遠(yuǎn)。

圖8 EgTP53蛋白和其他物種TP53蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹圖

2.8 去氫駱駝蓬堿對EgTP53 蛋白表達(dá)的影響用構(gòu)建的qRT-PCR反應(yīng)體系檢測EgTP53蛋白的表達(dá)量,與空白對照組和1%DMSO組相比,HM組EgTP53蛋白表達(dá)量顯著上升,見圖9。

圖9 EgTP53蛋白的表達(dá)結(jié)果圖

3 討論

TP53蛋白是一種核糖核酸結(jié)合蛋白,通常位于細(xì)胞核內(nèi),與DNA發(fā)生直接的相互作用[9]。它在細(xì)胞中以單體形式存在,但在響應(yīng)特定信號或損傷時(shí),可以形成二聚體或四聚體,以激活或抑制其調(diào)控作用[10]。研究表明,細(xì)粒棘球蚴感染可導(dǎo)致宿主肝細(xì)胞中TP53的活性增加,提示TP53 在Eg的生長發(fā)育過程中起到重要作用[11]。EgTP53的磷酸化位點(diǎn)比較多,多個(gè)磷酸化位點(diǎn)反映了蛋白質(zhì)在細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中的重要性,有助于EgTP53蛋白在不同的細(xì)胞狀態(tài)和環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整。

EgTP53蛋白的N末端區(qū)域缺少傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活域,這一區(qū)域是哺乳動物p53在調(diào)控轉(zhuǎn)錄和介導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)中非常重要的結(jié)構(gòu)域[12]。EgTP53蛋白主要由β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)成,表明它具有一定的柔性和可塑性,在多個(gè)生物過程中發(fā)揮作用,具有多功能性,容易改變細(xì)粒棘球蚴在寄生過程中的不同環(huán)境和生物學(xué)要求。EgTP53蛋白含有多個(gè)B細(xì)胞抗原表位,表明EgTP53蛋白在細(xì)粒棘球蚴的免疫系統(tǒng)中引起免疫應(yīng)答的潛力較高。這些抗原位點(diǎn)通常是蛋白質(zhì)上的特定區(qū)域,可以與免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞受體相互作用,引發(fā)抗體產(chǎn)生[13]。這對細(xì)粒棘球蟲的寄生能力和繁殖產(chǎn)生一定的影響,同時(shí)也為開發(fā)相關(guān)的診斷和治療方法提供一定的線索和參考。多重序列比對分析提示EgTP53蛋白與人親緣性較遠(yuǎn),根據(jù)其特征設(shè)計(jì)藥物更容易成為治療靶點(diǎn)[14-15]。

本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測EgTP53蛋白在HM處理后的表達(dá)水平升高,這表明EgTP53蛋白的活性得到了增強(qiáng)。通常情況下,TP53蛋白在細(xì)胞受到損傷或壓力時(shí)會被激活,從而協(xié)調(diào)細(xì)胞的應(yīng)激響應(yīng),包括但不限于DNA修復(fù)、細(xì)胞周期控制以及凋亡等細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的調(diào)控[16-17]。TP53通常是對DNA損傷的響應(yīng)者,本研究提示HM通過引發(fā)一系列細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng),導(dǎo)致EgTP53蛋白活性增強(qiáng)。

EgTP53蛋白結(jié)構(gòu)域中存在TUDOR蛋白結(jié)合域和兩個(gè)BRCT蛋白結(jié)合域。在DNA損傷修復(fù)過程中,TUDOR蛋白通常與甲基化的組蛋白或其他染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用并且通過與甲基化的DNA結(jié)合來調(diào)控DNA損傷信號的傳遞[18]。TDRD3是一種TUDOR蛋白,可以與甲基化的組蛋白H3K9me3結(jié)合,參與DNA單鏈斷裂的修復(fù)。此外,TUDOR蛋白還可以與DNA損傷響應(yīng)信號途徑中的其他關(guān)鍵蛋白,如ATM、ATR和53BP1等發(fā)生相互作用,調(diào)節(jié)DNA損傷信號的傳遞和DNA損傷修復(fù)過程[19]。TUDOR蛋白還可以通過參與非同源末端連接途徑來進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。Tudor-SN蛋白是一種TUDOR蛋白,在非同源末端連接途徑過程中發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)酶DNA-PKcs的磷酸化狀態(tài),促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的進(jìn)行[20]。BRCT結(jié)構(gòu)域是一種常見的蛋白結(jié)構(gòu)域,與DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過程密切相關(guān)。BRCA1蛋白可以與DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑的其他蛋白如BRCA2、RAD51和PALB2等發(fā)生相互作用,形成蛋白復(fù)合物,參與DNA損傷的修復(fù)和同源重組的過程[21-22]。BRCA1蛋白可以與核孔復(fù)合物發(fā)生相互作用,使DNA雙鏈斷裂的修復(fù)可以進(jìn)行到核內(nèi),有效地維持基因組的穩(wěn)定性。BRCA1蛋白可以調(diào)控細(xì)胞周期及進(jìn)行DNA信號的傳導(dǎo)。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷后,BRCA1蛋白可以激活A(yù)TM和ATR等激酶,進(jìn)而激活CHK1和CHK2等效應(yīng)蛋白,抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程,使細(xì)胞有足夠的時(shí)間進(jìn)行DNA損傷的修復(fù)。有研究表明,BRCA1蛋白在治療乳腺癌等腫瘤中具有一定的作用[23-25]。因此,基于TUDOR蛋白和BRCA1蛋白在DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控中的作用,可以考慮使用TUDOR蛋白和BRCA1蛋白作為治療細(xì)粒棘球蚴相關(guān)疾病的新策略,開發(fā)針對EgTP53-BRCT-BRCT結(jié)構(gòu)域的靶向藥物或基因治療方法,以達(dá)到更好的治療效果。

綜上所述,EgTP53在細(xì)粒棘球蚴的生長中扮演著重要的調(diào)控角色,DNA損傷通路參與了HM及其衍生物誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴死亡的過程,為深入了解Eg的致病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的治療包蟲病藥物靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。