劉 紅, 宋百靈, 馬雪紅, 李新霞

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 烏魯木齊 830017; 2伊犁州友誼醫(yī)院藥劑科, 新疆 伊寧 839300;3新疆胡蒜研究院(有限公司); 4新疆大蒜藥用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830013)

大蒜(AlliumsativumL.)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物的地下鱗莖,具有殺蟲、解毒、消腫、止痢、消食等功效,主要用于腹瀉、痢疾、鼻炎、銀屑病等疾病的治療[1-4]。大蒜辣素(Allicin)是從新鮮大蒜中分離得到的一種含硫化合物,具有多種藥理活性,如抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)血脂、降壓、降糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等[5-7]。大蒜辣素性質(zhì)不穩(wěn)定,易受多種因素影響,在一定程度上限制了其成藥性[8]。皮膚給藥的優(yōu)點(diǎn)在于避免了消化道對(duì)大蒜辣素的代謝。本研究通過建立離體大鼠完整背部皮膚及去角質(zhì)層皮膚透皮模型,采用超高效液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜串聯(lián)法(UPLC-MS-MS)測(cè)定大蒜辣素軟膏皮膚滲透特性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters沃特世公司);ACQUITY? TQD型質(zhì)譜儀(美國(guó)沃特世公司);Empower 3型液相工作站(美國(guó)沃特世公司);TP-6型智能透皮試驗(yàn)儀(天津市鑫州科技有限公司);AB135-S型分析天平(美國(guó)梅特勒公司);Milli-Q超純水系統(tǒng),Millipore超純水機(jī)(德國(guó)默克公司);2-16K型低溫離心機(jī)(德國(guó)賽多利斯公司)

1.2 試藥蒜氨酸 (新疆胡蒜研究院(有限公司),批號(hào)AL080317);蒜酶(新疆胡蒜研究院(有限公司),批號(hào)20171001),羥苯乙酯(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)20180324),色譜甲醇(美國(guó)Sigma-Aldrich公司,批號(hào)180630),色譜乙腈(美國(guó)Sigma-Aldrich,批號(hào)180331),色譜無水甲酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號(hào)2019013),0.9%氯化鈉注射液(西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司,批號(hào)C20180912),大蒜辣素軟膏(新疆胡蒜研究院(有限公司),批號(hào)20191015);空白軟膏(新疆胡蒜研究院(有限公司),批號(hào)20191035)。

1.3 動(dòng)物SD健康雄性大鼠50只,體重(200±20)g,SPF級(jí),由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(新) 2018-0003。在新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度20%～45%。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 大蒜辣素對(duì)照溶液的配置 取蒜氨酸對(duì)照品溶液和蒜酶溶液混勻,室溫反應(yīng)后超濾離心,取上清液,即得濃度為0.107 4 mg/mL的大蒜辣素對(duì)照溶液。

2.1.2 羥苯乙酯對(duì)照品溶液的配置 取羥苯乙酯對(duì)照品適量,用50%甲醇溶解并稀釋,搖勻即得濃度為0.200 7 mg/mL的羥苯乙酯對(duì)照品溶液。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱溫30℃,進(jìn)樣量8 μL,流速0.25 mL/min,流動(dòng)相A為0.1%甲酸,流動(dòng)相B為甲醇,梯度洗脫,梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件:電噴霧離子化(ESI),正離子,毛細(xì)管電壓為3.00 KV,離子源溫度為150℃,脫溶溫度為350℃,氬氣流速為150 L/h,氮?dú)饬魉贋?00 L/h,掃描模式為MRM 模式(多反應(yīng)離子掃描),定量離子選擇見表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 大蒜辣素和羥苯乙酯一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜電離碎片離子的分子量

2.3 UPLC-MS-MS方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 對(duì)照溶液的制備 取適量“2.1.1”項(xiàng)下的大蒜辣素對(duì)照液和“2.1.2”項(xiàng)下羥苯乙酯對(duì)照品溶液,搖勻即得對(duì)照溶液。

2.3.2 空白基質(zhì)軟膏接收液的制備 取空白軟膏適量,均勻涂布于固定在Franz擴(kuò)散池的大鼠皮膚上,5 h后得空白基質(zhì)軟膏接收液。

2.3.3 樣品溶液的制備 取大蒜辣素軟膏適量,均勻涂布于固定在Franz擴(kuò)散池的大鼠皮膚上,5 h后得樣品溶液。

2.3.4 樣品前處理 制備的溶液中加入乙腈500 μL,渦旋混勻2 min,再加入羥苯乙酯對(duì)照品溶液50 μL,12 000 r/min離心15 min,取上清液。

2.3.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取“2.3.1”、“2.3.2”和“2.3.3”項(xiàng)下的液體經(jīng)樣品前處理按“2.2”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣,采用二級(jí)譜,分別對(duì)163.00→73.00及167.07→138.88定量離子對(duì)進(jìn)行MRM掃描(圖1)。結(jié)果表明,在該色譜質(zhì)譜條件下空白基質(zhì)軟膏在兩個(gè)通道163.00→73.00大蒜辣素主峰及167.07→138.88內(nèi)標(biāo)峰處不出峰,被測(cè)物的色譜峰形良好,基線平穩(wěn),無雜峰干擾,具有良好的專屬性。

圖1 專屬性考察的MRM色譜圖(注: 1.大蒜辣素 2.羥苯乙酯)

2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取空白基質(zhì)軟膏接收液0.5 mL,分別加入不同濃度大蒜辣素溶液50 μL,得到濃度分別為:47.54、475.40、950.80、1 426.00、4 754.00 ng/mL的系列濃度溶液,經(jīng)樣品前處理后按“2.2”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以大蒜辣素溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),大蒜辣素與羥苯乙酯峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=0.005 2X-0.094 9,r=0.999 8,大蒜辣素在47.54 ～ 4 754.00 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.7 定量限與檢測(cè)限 取大蒜辣素對(duì)照品溶液適量,加入一定量的空白基質(zhì)軟膏接收液,經(jīng)樣品前處理后按“2.2”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以S/N≥10,測(cè)得大蒜辣素定量限為40.15 ng/mL;S/N≥3,測(cè)得大蒜辣素檢測(cè)限為18.06 ng/mL。

2.3.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取空白基質(zhì)軟膏接收液0.5 mL,分別加入不同濃度大蒜辣素溶液50 μL,得低、中、高濃度樣品溶液(335.6、657.1、986.1 ng/mL),每種濃度平行制備4份,按“2.2”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算不同濃度的日內(nèi)RSD值分別2.6%、1.1%、1.6%;每天測(cè)定1個(gè)分析批,連續(xù)測(cè)定5 d,計(jì)算不同濃度的日間RSD值分別4.1%、2.8%、2.9%,表明儀器的精密度良好。

2.3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下樣品溶液,按“2.2”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件對(duì)每個(gè)濃度連續(xù)測(cè)定6次,計(jì)算不同濃度的重復(fù)性,RSD值分別2.3%、1.7%、0.99%,表明重復(fù)性良好。

2.3.10 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下樣品溶液,分別置于室溫及0～4℃環(huán)境下,于0、2、4、6、8 h按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣分析;0～4℃條件下RSD值分別為2.9%、1.5%、1.1%;室溫條件下RSD值分別為8.6%、6.0%、4.9%,表明大蒜辣素樣品溶液在0～4℃條件下較穩(wěn)定,在室溫下放置8 h后,大蒜辣素樣品溶液RSD值未超過3.0%,表明在8 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.11 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取已知測(cè)定含量的樣品9份,分為3組,每組3份,分別加入低、中、高濃度(630.6、432.0、215.7 ng/mL)的大蒜辣素溶液,經(jīng)樣品前處理后,按“2.2”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣,計(jì)算回收率。低、中、高3種濃度大蒜辣素的平均回收率分別為90.36%、94.03%、94.54%,RSD分別為1.7%、1.7%、1.4%。

2.4 體外透皮試驗(yàn)

2.4.1 離體皮膚的制備 (1)完整皮膚的制備:大鼠腹腔注射10%水合氯醛2 mL致死,剔除背部皮膚的鼠毛,剪凈絨毛,剪下大鼠背部皮膚,剝離皮下粘連和脂肪組織,用生理鹽水反復(fù)沖洗,剪成適當(dāng)大小,置于加生理鹽水的密封袋中,-20℃保存,7 d內(nèi)使用。(2)去角質(zhì)層皮膚的制備:同法處理皮膚,再用膠帶條將表皮的角質(zhì)層粘去,得到去角質(zhì)層的大鼠背部皮膚。

2.4.2 供試品溶液的檢測(cè) 取處理好的離體皮膚,自然解凍,用生理鹽水清洗干凈,用濾紙吸干表面水分。將皮膚(完整皮膚、去角質(zhì)層皮膚)固定于Franz擴(kuò)散池中。在接收池中加入接收液溶液(生理鹽水)16 mL,池內(nèi)溫度為 37℃,300 r/min恒溫磁力攪拌,平衡30 min,使皮膚與液面緊密接觸。取大蒜辣素軟膏,精密稱定,均勻涂抹在皮膚表面,分別于0.5、 1、 2、 3、 4、 5 h取出0.5 mL接收液,同時(shí)向接收池中補(bǔ)加等體積同溫度的生理鹽水,取出的接收液經(jīng)樣品前處理后按照“2.2”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算單位面積累積透皮量(Q)。

圖2 大蒜辣素軟膏的透皮曲線

表3 體外釋藥模型擬合結(jié)果

表4 完整皮膚和去角質(zhì)層皮膚的體外透皮特性(n=5,

3 討論

外用制劑具有不受肝臟首過效應(yīng)和腸胃道破壞影響、可直達(dá)病灶部位的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),藥物透皮吸收效果直接決定藥效[9]。皮膚是藥物吸收的主要屏障,藥物需透過皮膚屏障到達(dá)靶組織發(fā)揮藥效。皮膚表面的角質(zhì)層是親脂性很強(qiáng)的生物膜,藥物的理化性質(zhì)對(duì)經(jīng)皮吸收能力至關(guān)重要。理想的經(jīng)皮吸收候選藥物要求分子量<600,熔點(diǎn)<200℃,油水分配系數(shù)logP在1～3之間[10]。大蒜辣素純品為無色油狀液體,分子量為162.3,油水分配系數(shù)logP為1.09,是較理想的候選藥物[11]。

通過對(duì)大蒜辣素軟膏在大鼠完整皮膚與去角質(zhì)層皮膚的透皮特性研究表明,大蒜辣素軟膏具有良好的透皮性能,兩種皮膚性質(zhì)的透皮吸收規(guī)律相似,累計(jì)釋藥量與時(shí)間線性關(guān)系良好,均符合 Higuchi方程,大蒜辣素軟膏在皮膚的吸收機(jī)制主要為被動(dòng)擴(kuò)散。去角質(zhì)層皮膚的J遠(yuǎn)高于完整皮膚,是完整皮膚的4.74倍,說明藥物經(jīng)皮吸收速率被皮膚的屏障作用所限制,角質(zhì)層是影響大蒜辣素透過皮膚的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明軟膏的有效成分大蒜辣素以原型形式透過皮膚,發(fā)揮藥效作用。課題組對(duì)大蒜辣素改善銀屑病樣皮損的研究已取得良好實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4],而銀屑病、濕疹、特異性皮炎和潰瘍等本身具有皮膚屏障功能損傷,當(dāng)使用藥物時(shí)可能會(huì)增加皮膚的吸收能力[12]。

本研究建立 UPLC-MS-MS測(cè)定透皮吸收液中大蒜辣素的分析方法,采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式,經(jīng)過母離子和子離子的雙重篩選,降低了基質(zhì)干擾。方法專屬性強(qiáng),靈敏度高,與課題組前期建立的大蒜辣素含量測(cè)定方法相比[13],檢出限提高100倍,為后續(xù)生物樣品中大蒜辣素定量分析提供了參考方法。