劉靜雨 曲 凡 單秋麗 何文興 陳安徽

（1徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇徐州 221028；2濟南大學生物科學與技術(shù)學院，山東濟南 250022）

桑黃（Sanghuang）是一種寄生于桑樹樹干處常年生真菌，名為桑黃屬桑黃，是桑黃屬成員。相關(guān)文獻表明桑黃主要活性成分能夠治療糖尿病和肺炎，以及在減輕感染性休克、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降低血脂、預防和治療自身免疫關(guān)節(jié)炎癥等方面起著重要作用，其中三萜、多糖和黃酮類化合物是3種主要的藥理活性化合物[1]。桑黃活性成分提取方法有醇提法和水提法，不同提取法所獲得的活性成分種類及功能不同[2-3]。TAJI等[4]在1968年證實桑黃子實體水提物具有較強的生物活性，可用于抑制小鼠肉瘤細胞的生長。此外，SHIBATA等[5]證實桑黃子實體醇提物能夠抑制肝癌細胞增殖的功能。并且近年來有大量關(guān)于桑黃藥用功能的研究報道，進一步描述這種真菌的抗腫瘤和抗氧化特性[6-7]。

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種在沒有過度飲酒的情況下，肝臟內(nèi)脂肪積累過多為主要特征的臨床病理綜合征[8]。近幾十年研究發(fā)現(xiàn)遺傳、飲食和環(huán)境因素的相互作用是NAFLD發(fā)病的媒介[9]。NAFLD的發(fā)病進程可分為單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatosis heptitis，NASH）以及肝硬化，最終嚴重危害人體生命健康[10]。近年的研究數(shù)據(jù)顯示：目前，NAFLD的全球發(fā)病率約為25%[11]，被認為是全球慢性肝病日益增長的重要原因，并已成為近年肝移植的主要原因之一[12]；在中國，NAFLD的患病人數(shù)急劇增加到30%[13]。

NAFLD的發(fā)病通常伴隨著各種代謝疾病的發(fā)生，如糖尿病和肥胖癥。它被認為是肝臟代謝綜合征的一種表現(xiàn)。Sanghuang Kangneng醇提物（ethanol Sanghuang Kangneng，ESK）主要提取Sanghuang Kangneng中多酚類和黃酮類化合物，前人研究顯示，部分多酚類和黃酮類化合物可改善NAFLD，但是對于其改善NAFLD的分子機制尚不明確。人正常肝細胞系WRL68細胞是一類永生化肝細胞株，對生長環(huán)境的改變有比較高的靈敏度。筆者以WRL68細胞作為體外試驗模型，研究ESK改善非酒精性脂肪肝的相關(guān)分子作用機制，為今后的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

FFA，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS），北京賽默飛世爾科技有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，北京賽默飛世爾科技有限公司；青霉素，北京索萊寶科技有限公司；鏈霉素，北京索萊寶科技有限公司；MTT試劑，北京索萊寶科技有限公司；油紅O，上海和序生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物公司；甘油三酯（TG）測試盒，南京建成生物工程研究所；總膽固醇（TC）測試盒，南京建成生物工程研究所；Triton X-100，北京索萊寶科技有限公司；Trizol，南京諾唯贊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；槲皮素，北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸，北京索萊寶科技有限公司；淫羊藿苷，北京索萊寶科技有限公司；蘆丁，北京索萊寶科技有限公司；綠原酸，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ESK提取

桑黃產(chǎn)于江蘇省，由徐州工程學院陳安徽鑒定并命名為Sanghuang Kangneng。稱取Sanghuang Kangneng20 g，置50 ℃烘箱內(nèi)烘至4 h，研磨過篩（孔徑0.85 mm）。加入10倍體積的90%乙醇85 ℃索氏提取2 h。布氏漏斗過濾提取溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)五分之四溶液，濃縮液低溫冷凍干燥成粉末（命名為ESK），所提取的ESK放置-20 ℃長期保存。

1.2.2 高效液相色譜分析

高效液相色譜分析ESK樣品溶液的配置：準確稱取ESK樣品10 mg，將其溶解于1 mL甲醇（色譜級），10 000g離心20 min，配成樣品儲備液，過0.22 μM無菌濾膜過濾，收集液體部分。高效液相色譜分析標準溶液的配置：取槲皮素、沒食子酸、咖啡酸、淫羊藿苷、蘆丁、綠原酸標準品各10 mg，將其溶解于1 mL甲醇（色譜級），10 000g離心20 min，配成標準混合樣品儲備液，用0.22 μM無菌濾膜過濾。

色譜條件：色譜柱選擇YMC-Pack ODS-AQ反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相由A、B兩部分組成，A相：乙腈∶甲醇∶超純水（體積比）=19∶5∶76（pH 3.0）；B相：乙腈∶甲醇∶超純水（體積比）=55∶15∶30（pH 3.0）。流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為256 nm；進樣量為10 μL，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 細胞培養(yǎng)

人正常肝細胞（WRL68）購買于上海傳秋生物科技有限公司（上?？偛浚?，在高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞時在培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清、100 mol/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，將細胞放置于37 ℃和5% CO2的細胞恒溫箱中進行體外培養(yǎng)。

1.2.4 細胞活力測定

使用MTT比色法檢測細胞活力。收集并重懸細胞，控制細胞接種密度，將藥物暴露24 h、48 h的細胞和藥物暴露72 h的不同密度的細胞接種于96孔板中。質(zhì)量濃度為5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，待細胞貼孔底壁后對其進行不同質(zhì)量濃度的藥物暴露，分別按照100 μL/孔的暴露體積進行處理，隨后將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。藥物處理結(jié)束后，將原加藥物的培養(yǎng)基吸出，每孔加入100 μL新培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液（5 mg/mL），混勻，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后，將孔板內(nèi)培養(yǎng)基棄去，每孔加150 μL DMSO，孔內(nèi)形成的結(jié)晶物充分溶解后，再用酶標儀在490 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.5 油紅O染色

收集并重懸細胞，控制細胞接種密度，在24孔板里藥物暴露24 h+72 h的細胞接種密度為1.6×105個/孔，質(zhì)量濃度為5%CO2、37 ℃條件過夜培養(yǎng)，待細胞貼孔底壁進行暴露試驗；暴露結(jié)束后，將24孔板里原加藥物的培養(yǎng)基吸出，用PBS輕洗；每孔加入200 μL質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛，避光固定30 min后，用PBS輕洗；每孔快速滴加200 μL油紅O工作液，避光染色20 min；每孔加適量質(zhì)量分數(shù)為60%的異丙醇漂洗1 min，去掉浮色后用滅菌水漂洗至無色。鏡下觀察并成像。

1.2.6 細胞內(nèi)總蛋白、TG和TC含量測定

將藥物處理的細胞胰酶消化后分別收集于對應標記的EP管中，離心后棄上清；用滅菌PBS洗滌細胞沉淀2～3次，再次離心棄上清；每管中加入1%Triton X-100 30 μL，用旋渦振蕩儀將細胞沉淀振蕩開，冰上裂解細胞2 h，每隔30 min用旋渦振蕩儀對細胞沉淀振蕩使其充分裂解。吸取上裂解液，按照試劑盒說明書測定細胞內(nèi)TG、TC以及總蛋白的含量。

1.2.7 實時熒光定量PCR

使用Trizol法提取各組細胞的mRNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)表2反應條件進行實時熒光定量PCR，結(jié)果根據(jù)各組Ct值，使用2-△△Ct法計算目的基因與內(nèi)參基因β-actin的相對表達量（基因相對表達量計算公式使用2-ΔΔCt：其中ΔCt為目的基因和內(nèi)參基因Ct值差值）。所有引物信息如表3，以β-actin為內(nèi)參標準化目的基因。

表2 實時熒光定量PCR反應條件

表3 WRL68 qRT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism7軟件進行統(tǒng)計學分析和作圖。樣品重復孔數(shù)為3，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準誤。兩個組之間的比較選擇t檢驗，多組間比較選擇雙因素方差分析，*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品定性分析結(jié)果

通過對比標準品HPLC圖譜（圖1）可以推斷出，ESK中含有槲皮素、沒食子酸、咖啡酸、淫羊藿苷、蘆丁、綠原酸物質(zhì)。

圖1 HPLC定性分析結(jié)果

2.2 ESK對WRL68細胞活力和脂質(zhì)代謝的影響

如圖2所示，暴露于ESK24 h后，WRL 68細胞凋亡數(shù)目無明顯增加，然而與對照相比，暴露于32 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL的ESK48 h以及72 h細胞凋亡數(shù)目增加，160 μg/mL的ESK培養(yǎng)正常細胞72 h，細胞凋亡15%；相同處理時間320 μg/mL藥物暴露細胞凋亡為對照的23%，均在藥物處理細胞凋亡可接受范圍內(nèi)，因此選3.2 μg/mL、32 μg/mL、160 μg/mL以及320 μg/mL的ESK72 h處理。

圖2 ESK不同時間及質(zhì)量濃度暴露對WRL68細胞活力的影響

如圖3a所示，與高脂細胞未進行ESK處理的對照相比，ESK處理72 h后，高脂細胞內(nèi)TG含量顯著降低，并且隨著ESK質(zhì)量濃度的進一步增加，TG含量也逐漸降低。3.2 μg/mL的ESK暴露使得高脂WRL68細胞內(nèi)TG含量顯著減少37%（P＜0.01），并且發(fā)現(xiàn)3.2 μg/mL的ESK不影響高脂細胞內(nèi)TC水平，而用32 μg/mL和160 μg/mL的ESK暴露時，TC含量分別顯著降低40%和35%（P＜0.001，圖3b）。然而，盡管320 μg/mL的ESK處理會顯著降低高脂WRL68細胞內(nèi)TC含量（降低22%，P＜0.001），但相較于160 μg/mL的ESK處理，高脂細胞內(nèi)TC水平卻略有上升。此外，油紅O染色結(jié)果顯示：相比較于高脂細胞未進行ESK處理的對照，32 μg/mL和160 μg/mL的ESK處理能夠顯著降低WRL68細胞內(nèi)脂滴（箭頭）的形成（圖4）。

圖3 ESK對高脂細胞內(nèi)脂質(zhì)水平的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度ESK對高脂WRL68細胞油紅O染色影響

2.3 ESK對WRL68細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

為了初步闡明ESK減少高脂WRL68細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的潛在機制，分別從脂質(zhì)運輸、脂質(zhì)合成和脂質(zhì)氧化方面來探討ESK的作用機制。如圖5a、5b所示，與高脂細胞未進行ESK處理的相比，320 μg/mL的ESK處理能夠顯著降低高脂細胞內(nèi)參與脂質(zhì)生成的Srebp-1c和Fas的表達，分別降低51%和39%（P＜0.05）。此外，32 μg/mL的ESK處理還能顯著下調(diào)參與脂質(zhì)運輸?shù)年P(guān)鍵基因如CD36（下調(diào)29%，P＜0.05）的表達水平（圖5c）。而脂質(zhì)氧化相關(guān)基因PPARα表達沒有變化（圖5d）。

圖5 ESK對高脂WRL68細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

3 小結(jié)

目前NAFLD是世界上常見的疾病之一，已成為研究熱點，迫切需要治療NAFLD新的藥物。Sanghuang Kangneng是一種寄生于桑樹樹干處常年生真菌，其主要核心成分已知。以前的研究報道Sanghuang可以防止急性肝毒性和調(diào)節(jié)肝功能[14]。在目前的研究中，使用的FFA誘導模型，是一個被廣泛接受的高脂肝細胞模型。筆者首次確定ESK在減輕高脂肝細胞內(nèi)脂積累、治療NAFLD發(fā)病機制中的作用。

TC和TG是機體發(fā)生高脂相關(guān)癥狀時常需檢測的重要指標，當這兩種生化指標異常時，初步認定檢測的細胞或組織內(nèi)部脂代謝異常。為了顯示細胞內(nèi)的脂肪含量常采用油紅O進行細胞染色，因為油紅O是一種脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能夠高度溶解，因此其可特異性的使組織內(nèi)TC等中性脂肪染為紅色。ESK顯著減少了高脂肝細胞內(nèi)TC和TG含量，油紅O染色圖顯示ESK顯著減少了高脂肝細胞內(nèi)中性脂肪含量，因此可初步判斷ESK減少了高脂肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積累。

利用WRL68細胞作為體外試驗模型，通過設(shè)計不同的暴露劑量，考察ESK暴露對WRL68細胞的活力影響。在ESK處理FFA誘導的高脂細胞模型試驗中，高脂WRL68細胞隨ESK質(zhì)量濃度增加，細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積顯著降低。通過qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ESK暴露可顯著影響高脂WRL68細胞內(nèi)與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達，其可能的模式有通過抑制細胞內(nèi)SREBP-1c和Fas基因表達，抑制脂質(zhì)合成，以及通過激活PPARα來促進肝細胞內(nèi)脂肪酸氧化，這些可減緩NAFLD的第一發(fā)病階段。