魏 杰

（江蘇省徐州市動物疫病預防控制中心，江蘇 徐州 221006）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDⅤ）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，發(fā)病豬常常以水樣腹瀉、嘔吐、精神沉郁和食欲下降為主要癥狀[1]。各種年齡的豬均易感，仔豬病死率可達90%以上[2]。我國在1973 年就分離到PEDⅤ（經典毒株）。近年來，PED 持續(xù)發(fā)生和流行對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成重大影響，一些規(guī)?；i場因集約化的發(fā)展模式，PEDⅤ暴發(fā)所造成的經濟損失更為慘重[3]。

1 豬流行性腹瀉疫情發(fā)生、流行的成因

經研究，豬流行性腹瀉病毒變異株是疫情發(fā)生、流行的元兇。豬流行性腹瀉病毒變異株與原來的PEDⅤ毒株（經典毒株）的基因組同源性在97%左右，變異最大的為S 基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸發(fā)生缺失和插入的序列特征。由于PEDⅤ變異株在基因組上的高度變異導致其致病性和免疫原性發(fā)生重大改變，使該病在PEDⅤ疫苗免疫的豬群中也不斷發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。

2 仔豬腹瀉病流行病學調查

2.1 開展豬場飼養(yǎng)管理情況調查

通過對全市15 個養(yǎng)殖豬場（戶）近些年仔豬腹瀉病調查，該病發(fā)病率在15.7%～33%之間，死亡率在21.2%～42.5%之間。規(guī)模越大的豬場，仔豬腹瀉病率發(fā)生率越低，規(guī)模越小的豬場，仔豬的腹瀉病越嚴重。接種豬傳染性胃腸炎疫苗（T疫苗）和豬流行性腹瀉疫苗（P 疫苗）能明顯降低仔豬腹瀉發(fā)病率和死亡率。

通過調查，仔豬腹瀉病多流行于寒冷季節(jié)。仔豬腹瀉發(fā)病率以母豬存欄50 頭以下的最高，母豬存欄100 頭以上的相對較低，尤其是小于10日齡的仔豬，死亡率可達100%。其主要原因多為小型豬場或散戶設施設備簡陋，飼養(yǎng)管理不規(guī)范，防疫條件比較薄弱，豬場衛(wèi)生環(huán)境差等多種因素造成。

2.2 開展多病原感染情況調查

對不同日齡、不同豬場的豬糞樣進行了多病原的檢測，其中豬流行性腹瀉病毒陽性率為37.7%；TGEⅤ陽性率僅為0.53%；輪狀病毒陽性率為5.46%；脊病毒陽性率最高，為98.11%；PEDⅤ和脊病毒混合感染陽性率高達66.04%；其他病原的混合感染也都在7%以上，結果表明PEDⅤ是引起仔豬腹瀉的主要病原，而且非常容易和其他病原發(fā)生混合感染。

3 仔豬腹瀉病檢測技術研發(fā)

3.1 豬流行性腹瀉病毒變異株RT-PCR 試劑盒研發(fā)

根據變異株S 基因變異的特點設計引物，只能擴增變異株，可以區(qū)分經典毒株，擴增后制備陽性質粒，以陽性重組質粒為模板進行了各種條件的摸索，優(yōu)化了引物濃度及混合液的配比，確定了RT-PCR 一步法擴增的條件。通過倍比稀釋模板，確定了RT-PCR 檢測的敏感性為100 拷貝/μL。用所組裝的試劑盒對30 份豬流行性腹瀉病毒陽性組織樣品以及30 份豬流行性腹瀉病毒陰性樣品分別重復檢測3 次。結果表明，重復的三次結果一致，初步表明試驗所組裝的檢測試劑盒具有良好的重復性。試劑盒的保存期試驗：-20 ℃度保存8 個月，檢測其敏感性、特異性均未改變。

3.2 雙抗體夾心ELⅠSA 抗原定量-檢測技術研發(fā)

為了能夠對臨床樣品中的PEDⅤ進行抗原定量，對病毒的N 蛋白進行了表達，制備了單克隆抗體，建立了雙抗體夾心ELⅠSA 方法，以已知濃度的N 蛋白作為標準品，可以對臨床病料中的PEDⅤ進行抗原定量檢測，該試劑盒敏感性較好，最低能檢測1 ppb 蛋白，可以實現高通量、定量檢測抗原的目的，同時還可以檢測疫苗中的有效抗原含量，為PEDⅤ的定量檢測和疫苗評估提供了有力的工具。

3.3 PEDⅤ超敏感膠體金快速檢測技術研發(fā)

對臨床上流行的PEDⅤ變異毒株的N 蛋白進行了表達，制備了30 株單克隆抗體，對抗體進行配對篩選和條件優(yōu)化，建立了膠體金快速抗原檢測試紙條，該試紙條最低檢測靈敏度可達10-4TCⅠD50，比韓國進口試紙條敏感10 倍，成本低廉，且檢測時間只需要15 min，不需要任何檢測儀器，肉眼即可判斷結果，非常適用于基層臨床檢測，能夠簡便、快速地對PEDⅤ進行檢測與診斷。

4 開展豬流行性腹瀉病毒疫苗開發(fā)和免疫技術研究

4.1 開展豬流行性腹瀉病毒變異株和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)細胞滅活苗研究

4.1.1 毒株的克隆純化與高滴度篩選 通過3 次空斑純化、克隆篩選到了高滴度的豬流行性腹瀉病毒變異株（107.5TCⅠD50/mL）和豬傳染性胃腸炎病毒（108.5TCⅠD50/mL）。

4.1.2 疫苗滅活方式的選擇 分別用甲醛和二氧化氫滅活病毒，氫氧化鋁為佐劑，檢測不同滅活方式的疫苗免疫效果。實驗結果顯示：用甲醛滅活病毒制備的疫苗保護率為2/3；二氧化氫滅活制備的疫苗保護率為1/3。

4.1.3 疫苗佐劑的選擇及免疫效力試驗 分別選取了4 種水佐劑（AD1、AD2、AD3、鋁）、2 種油佐劑（HⅤ、H45）制備滅活疫苗，分別從主動免疫和被動免疫兩個方面比較了各種疫苗的免疫效力。

主動免疫：AD1 佐劑組和AD3 佐劑組抗體水平最高，在免疫3 周后，抗體開始上升，第7周達到最高。被動免疫：于母豬分娩前1 個月免疫，對產后5 日齡仔豬進行抗體檢測和攻毒。AD1 佐劑組和AD3 佐劑組具有較好的免疫效力，攻毒保護率分別達到80%和70%。

與同類產品的比較試驗：于母豬分娩前1 個月免疫本實驗的兩組疫苗和市場上所售的豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活苗，對產后5日齡仔豬進行抗體檢測和攻毒。結果顯示，AD1佐劑組保護率最高，可達到80%；AD3 佐劑組和在售疫苗免疫效力相當，中和抗體水平在1:35 左右，攻毒保護效果較差，TGEⅤ和PEDⅤ攻毒全部發(fā)病。

4.1.4 安全性試驗 將疫苗一次單劑量、單劑量重復和一次超劑量分別接種3～5 日齡仔豬和懷孕母豬測定其體溫變化、臨床癥狀，觀察接種部位、母豬的產仔情況等。免疫后28 d，剖殺免疫組和對照組，觀察接種部位變化。結果顯示免疫后母豬各方面指標正常，無不良反應，表明該疫苗對母豬和仔豬均是安全的。

4.2 豬流行性腹瀉病毒弱毒株培育技術

對分離的豬流行性腹瀉病毒AH2012/12 在Ⅴero 細胞上連續(xù)傳代130 代，分別對第1、20、60、90、130 代代毒株進行了致病性試驗及S 基因的序列分析比較。結果顯示，第1 代、第20代攻毒后仔豬全部發(fā)生腹瀉，發(fā)病率為100%。第60 代攻毒后致病性減弱，第90 代病毒無致病性，全部不發(fā)病，表明病毒已經被弱化。S 基因的序列比對發(fā)現，從第90 代開始，出現了特征性的氨基酸突變，突變?yōu)榻浀淙醵局甑奶卣?，表明毒株被有效致弱，可以作為弱毒疫苗株，且遺傳較為穩(wěn)定。

4.3 開展酵母細胞壁免疫多糖配伍T-P 二聯(lián)苗免疫效果試驗

酵母細胞壁免疫多糖具有免疫佐劑功能，能夠提高抗體效價，提高巨噬細胞對許多病原，如病毒、細菌、真菌和寄生蟲的抵抗能力，進而改善機體免疫系統(tǒng)對外源病原入侵的抵抗力。這也通過實驗得到了證明（表1），試驗一組采用T-P二聯(lián)苗后海穴接種免疫，試驗二組采用T-P 二聯(lián)苗免疫同時使用酵母細胞壁免疫多糖，對照組未免疫也未使用酵母細胞壁免疫多糖。與對照組相比，試驗一組仔豬出欄率和抗體水平分別提高10.9%和 240%，發(fā)病率和死亡率分別降低70.99%和74.5%；試驗2 組與試驗1 組相比，仔豬出欄率和抗體水平分別提高0.35%和11.76%，發(fā)病率和死亡率分別降低29.2%和58.22%；且試驗二組仔豬整體狀態(tài)表現為精神狀態(tài)良好，糞便成型，皮毛光滑，明顯優(yōu)于試驗一組。

表1 T、P 二聯(lián)疫苗免疫和免疫多糖應用效果

4.4 自制疫苗

根據豬場要求，采集發(fā)病癥狀比較典型的仔豬小腸，經過研磨、勻漿、過濾和滅活等程序，制造出針對該豬場毒株的組織滅活疫苗進行緊急免疫[2]。

4.5 優(yōu)化免疫程序

根據我市及周邊地區(qū)生豬疫病流行特點，進一步優(yōu)化免疫程序，制定出適合本地生豬養(yǎng)殖業(yè)的科學合理的免疫程序并推廣。生豬發(fā)病率顯著降低，抗生素藥物使用明顯減少。

5 完善各項飼養(yǎng)管理措施

5.1 環(huán)境控制

哺乳仔豬豬舍環(huán)境溫度控制為25～30 ℃，豬舍的濕度一般控制在50%～70%。要經常通風換氣，保持舍內空氣新鮮。冬季可適當提高飼養(yǎng)密度保暖，夏季可降低飼養(yǎng)密度降溫。飼養(yǎng)密度應為0.8～1.0 m2/頭，每圈10～15 頭為宜。

5.2 斷奶仔豬培育技術

目前，多數豬場將4～5 周齡斷奶仔豬投入肉豬生產場進入育肥階段飼養(yǎng)。但由于受飼料和環(huán)境因素的影響，很容易發(fā)生以斷奶腹瀉為主要特征的斷奶綜合癥。主要表現仔豬腹瀉、水腫，采食量降低、消瘦，被毛粗亂，皮膚蒼白，抵抗力下降。這主要是由于斷奶仔豬消化機能較弱，抗逆性差，免疫機制不健全等生理、環(huán)境、營養(yǎng)因素而造成的。因此，做好斷奶仔豬各項保育措施（表2），安全度過保育期十分重要。

表2 斷奶仔豬保育階段管理措施

5.3 建立小單元化飼養(yǎng)和全進全出制度

小單元化飼養(yǎng)全進全出有利于豬場疫病防控，提高豬場的生產水平。從分娩、保育到育成育肥采用“全進全出”的飼養(yǎng)方式，并將保育期分為保育前期（3 周）和保育后期（2 周），做到同一棟豬舍的豬群同時全部轉出，配種舍和懷孕舍也應采取全進全出生產模式。

6 小結

通過對發(fā)病豬場開展仔豬腹瀉病流行病學調查，檢測出造成腹瀉病的主要病原，篩選建立生豬腹瀉病病原快速檢測方法，制定相關快速診斷檢測技術規(guī)程，研發(fā)出豬腹瀉病疫苗，開展酵母細胞壁免疫多糖配伍T-P 二聯(lián)苗免疫效果等試驗，進一步優(yōu)化免疫程序，建立示范場開展仔豬腹瀉病綜合防控試驗等一系列疫病防控措施，逐步推廣仔豬腹瀉病綜合防控技術，使仔豬腹瀉病發(fā)病率、死亡率均有所下降，提高了廣大生豬養(yǎng)殖場生產效率和經濟效益。