王一新，張真研，曹鳳陽，李 陽，徐瑞雪，謝之景，崔言順，李建亮*

（1.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東 青島）

不育α 基序和組氨酸/天冬氨酸蛋白（Sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domaincontaining protein 1，SAMHD1）于2000 年被首次發(fā)現，該蛋白主要存在于免疫細胞，如單核細胞和樹突狀細胞中[1]。SAMHD1 蛋白由無菌α 基序（SAM）結構域和組氨酸-天冬氨酸（HD）結構域構成，前者負責蛋白質-蛋白質和蛋白質-核酸相互作用，后者則具有蛋白磷酸水解酶和核酸酶活性[2]。SAMHD1 蛋白從原核生物到真核生物均保守存在，該蛋白廣泛參與了細胞周期調控、細胞穩(wěn)態(tài)維持、DNA 損傷應答、免疫反應調節(jié)等過程，具有多種生物學功能[3]。

近年來的研究表明，作為一種重要的先天免疫限制因子，SAMHD1 還可以抑制反轉錄病毒的增殖、降低抗病毒免疫反應和炎癥反應[4-5]。SAMHD1 能夠調控細胞內的dNTP 含量，從而抑制包括人類免疫缺陷病毒（HⅠⅤ）在內的多種逆轉錄病毒的感染[1]，如貓免疫缺陷病毒（FⅠⅤ）、小鼠白血病病毒（MuLⅤ）、馬傳染性貧血病毒（EⅠAⅤ）和牛免疫缺陷病毒（BⅠⅤ）等[6]。此外，SAMHD1 也可以抑制某些DNA 病毒在宿主細胞中的復制，如單純皰疹病毒1 型（HSⅤ-1）和痘病毒[7]。

SAMHD1 蛋白具有種屬特異性，豬源及馬屬動物源SAMHD1 已被證實具有抗病毒活性[8-9]。雞源SAMHD1（chSAMHD1）基因位于雞基因組第20 號染色體，編碼614 個氨基酸，與人SAMHD1 蛋白同源性僅有60%左右，其生物學功能尚不清楚。本試驗首先將chSAMHD1 的HD結構域克隆至pET32a（+）載體，構建原核表達質粒，并在BL2（DE3）大腸桿菌中誘導表達；隨后將重組蛋白免疫SPF 級6 周齡BALB/c 小鼠制備抗chSAMHD1 多克隆抗體，并對所制備的多克隆抗體的反應性進行鑒定，從而為chSAMHD1 生物學功能的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 質粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化試劑盒購自廣州飛揚生物工程有限公司；常規(guī)限制性內切酶EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA連接酶、PrimeScript? One Step RT-PCR 試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α 和BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京擎科生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）及FⅠTC 熒光素標記的山羊抗鼠ⅠgG 購自北京全式金生物技術有限公司；鎳預裝柱購自金斯瑞生物科技有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma 公司。

1.1.2 實驗動物 SPF 級BALB/c 小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；原核表達載體pET-32a（+）和雞胚成纖維細胞系DF-1 由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 chSAMHD1 基因擴增及重組質粒構建 根據chSAMHD1 基因序列（GenBank 登錄號：NM_001030845.2）設計引物，擴增chSAMHD1基因HD 結構域（開放閱讀框第301-1 845 nt）序列。上游引物chSAMHD1-F: 5′-GAATTCATGCA GACAGCAGACATCATGA-3′，下游引物 chSA MHD1-R: 5′- GTCGACTTACTTATTGAAAGAG AGCT-3′，在上、下游引物的5′端分別引入EcoRⅠ和Sal Ⅰ 酶切位點。提取雞淋巴細胞RNA，通過RT-PCR 擴增chSAMHD1 基因序列。反應體系為：PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL，2×Buffer 25 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，RNA 4 μL，RNase-Free dH2O 17 μL。反應程序為：50 ℃ 反轉錄30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，進行30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存。通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物，并用回收試劑盒進行切膠純化。

1.2.2 pET-chSAMHD1 原核表達質粒的構建 使用限制性內切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ分別酶切pET-32a（+）載體和chSAMHD1 擴增片段，并用膠回收試劑盒純化相應的酶切產物。使用T4 DNA 連接酶連接后轉化至DH5α 大腸桿菌，挑取單克隆進行菌液PCR 鑒定，將陽性菌液送北京擎科生物科技有限公司進行測序。驗證正確的提取質粒（命名為pET-chSAMHD1），置于-20 ℃ 保存、備用。

1.2.3 chSAMHD1 重組蛋白的誘導表達及純化將pET-chSAMHD1 轉化至BL21（DE3）大腸桿菌，挑取單克隆菌落接種于5 mL LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天取出其中 1 mL 菌液轉接于200 mL LB 培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600 約為0.6 時，加入ⅠPTG 誘導表達（終濃度為0.1 mmol/L），32 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)6 h。隨后12 000 r/min 離心10 min 收集菌體，使用10 mL PBS 重懸后超聲破碎，分別將上清和沉淀進行SDS-PAGE 電泳，分析重組蛋白的表達形式。使用鎳柱進行蛋白純化，分別用6、4、2 mol/L 濃度的尿素和PBS 緩沖液透析。BCA 法定量后分裝，置于-80 ℃ 保存。

1.2.4 chSAMHD1 重組蛋白的Western blot 鑒定將純化的chSAMHD1 重組蛋白經SDS-PAGE 電泳后轉移至PⅤDF 膜，加入1%的BSA 封閉1 h；棄封閉液，加入1:500 倍稀釋的鼠抗His 抗體，4 ℃ 孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜；然后加入1:1 000 倍稀釋的HRP 標記的山羊抗鼠ⅠgG 二抗，室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜；最后加入顯影液，通過成像系統(tǒng)測定chSAMHD1 重組蛋白與抗His 抗體的反應性。

1.2.5 chSAMHD1 蛋白多克隆抗體的制備 將純化的chSAMHD1 重組蛋白與弗式完全佐劑乳化后（體積比1:1），采用背部皮下注射的方式免疫5 只SPF 級6 周齡BALB/c 小鼠，每只免疫100 μg。2 周后，用chSAMHD1 重組蛋白與弗式不完全佐劑乳化后加強免疫（體積比1:1）；2 周后，以同樣的方式進行三免。三免10 d 后斷尾采血并分離收集血清，分裝后置于 -20 ℃ 保存。

1.2.6 chSAMHD1 多克隆抗體效價的測定 通過間接ELⅠSA 測定chSAMHD1 多克隆抗體效價。將重組chSAMHD1 蛋白包被ELⅠSA 板（0.1 μg/孔），4 ℃ 孵育過夜；加入5%脫脂奶粉封閉1 h；將制備的 chSAMHD1 多克隆抗體以1:1 000 ～1:512 000 稀釋，加入到反應板中（100 μL/孔），37 ℃ 孵育1 h，PBST 洗滌3次；加入1:2 000 稀釋的HRP 標記的羊抗鼠ⅠgG（100 μL/孔），37 ℃ 孵育1 h，PBST 洗滌3 次；加入100 μL TMB 底物顯色液（100 μL/孔），37 ℃ 反應5 min 后加入2 mol/L H2SO4（100 μL/孔）終止反應；使用酶標儀測定OD450 值，以OD 值≥0.21 為臨界值，計算效價。

1.2.7 間接免疫熒光試驗（ⅠFA）檢測多克隆抗體反應性 將chSAMHD1 真核表達質粒pcDNAchSAMHD1 轉染至DF-1；36 h 后，用4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS 洗5 次；加入1:100 倍稀釋的鼠抗chSAMHD1 多克隆抗體，4 ℃ 孵育過夜，PBS 洗5 次；加入FⅠTC 標記的山羊抗鼠ⅠgG 二抗，37 ℃ 孵育1 h，PBS 洗5 次，通過熒光顯微鏡進行觀察。

2 結果

2.1 chSAMHD1 原核表達質粒的構建

提取雞淋巴細胞RNA，RT-PCR 擴增部分chSAMHD1 基因序列，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結果表明成功擴增到與預期大小接近的目的片段（圖 1）。將目的片段克隆至 pET-32a（+）載體，對構建的pET-chSAMHD1 質粒進行雙酶切鑒定，結果可見1 545 bp（目的基因）和6 000 bp（載體）兩個條帶（圖2）。挑取陽性克隆進行測序驗證，結果顯示所擴增的序列與理論序列同源性為100%，無點突變發(fā)生。

圖1 部分chSAMHD1 基因的擴增

圖2 pET-SAMHD1 質粒的雙酶切驗證

2.2 chSAMHD1 重組蛋白的誘導表達與純化

將 pET-chSAMHD1 質粒轉化至 BL21（DE3）大腸桿菌，加入終濃度為0.1 mmol/L 的ⅠPTG 進行誘導表達并分析蛋白可溶性。SDSPAGE 電泳結果顯示，chSAMHD1 重組蛋白約75.0 kDa，與預期大小一致，且目的蛋白主要以包涵體形式表達（圖3）。經Ni 柱純化后，可見單一目的條帶（圖 4 ）， 表明所制備的chSAMHD1 重組蛋白純度較高。

圖3 chSAMHD1 蛋白的表達分析

圖4 chSAMHD1 蛋白的純化分析

將純化的 chSAMHD1 重組蛋白經 SDSPAGE 電泳后轉印至PⅤDF 膜，通過Western blot分析蛋白的反應原性。結果表明，重組chSAMHD1蛋白可以與抗His 抗體發(fā)生特異性反應（圖5）。

2.3 chSAMHD1 重組蛋白的反應原性鑒定

圖5 純化蛋白的Western blot 鑒定

2.4 chSAMHD1 多克隆抗體的制備及抗體效價測定

將純化的重組chSAMHD1 蛋白用弗氏佐劑乳化后免疫6 周齡BALB/c 小鼠，三免后收集血清，采用間接ELⅠSA 測定多克隆抗體效價。結果表明，本試驗所制備的抗chSAMHD1 多克隆抗體的抗體效價可達1:256 000，可滿足后續(xù)試驗需求。

2.5 chSAMHD1 多克隆抗體反應性的ⅠFA 鑒定

將 chSAMHD1 真核表達質粒 pcDNAchSAMHD1 轉染DF-1 細胞，以1:100 稀釋的chSAMHD1 多克隆抗體作為一抗進行ⅠFA 試驗。結果顯示，抗chSAMHD1 多克隆抗體能夠與轉染真核表達質粒的DF-1 發(fā)生特異性反應，表明該抗體具有良好的反應性（圖6）。

圖6 多克隆抗體對真核表達chSAMHD1 蛋白的ⅠFA 檢測

3 討論與結論

SAMHD1 是一種在多種物種中廣泛表達的脫氧核苷酸三磷酸水解酶（dNTPase），該蛋白由無菌α 基序（SAM）結構域和組氨酸-天冬氨酸（HD）結構域組成。一般認為，SAM 結構域介導蛋白質與蛋白質或蛋白質與核酸的相互作用，而HD 結構域則發(fā)揮dNTPase 活性[3]。SAMHD1可形成四聚體，這種寡聚作用是其催化dNTPase活性所必需的。SAMHD1 可將dNTP 轉化為脫氧核苷和三磷酸鹽，從而抵消dNTP 的從頭合成[6]。

近年來的研究表明，SAMHD1 是一種可對抗多種病毒的宿主限制因子。研究人員最早在非增殖性髓系細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞中發(fā)現SAMHD1 可抑制HⅠⅤ-1 的復制[1-3]。由于HⅠⅤ-1等反轉錄病毒需要以前病毒cDNA 的形式將其整合到宿主基因組中，因此反轉錄病毒需要較高的細胞內dNTP 水平進行逆轉錄。在非分裂細胞中，SAMHD1 通過下調細胞內dNTP 的濃度來限制病毒的復制[10]。除了HⅠⅤ-1，SAMHD1 也可以抑制乙型肝炎病毒（HBⅤ）、人巨細胞病毒（Human cytomegalovirus, HCMⅤ）、痘病毒等DNA 病毒的復制。對于不同病毒，SAMHD1 可通過不同的機制發(fā)揮抗病毒功能。HBⅤ 通過RNA 中間體和逆轉錄步驟復制其病毒DNA 基因組，因此SAMHD1 的dNTPase 活性可以有效地限制細胞中 HBⅤ DNA 的復制[11]。此外，SAMHD1 可直接結合NF-κB，阻斷NF-κB 與病毒啟動子的結合，從而抑制HCMⅤ早期基因的表達，進而抑制病毒復制[12]。

在不同物種中，SAMHD1 也具有一定的抗病毒作用。如豬源SAMHD1 可以通過抑制RNA 的合成來抑制豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSⅤ）。但是，關于雞源SAMHD1 蛋白的功能、作用及調控機制的報道較少。研究發(fā)現，chSAMHD1 與人 SAMHD1 蛋白同源性約 62%，具有與人SAMHD1 蛋白類似的結構組成，并且chSAMHD1同樣具有dNTP 水解酶和核酸酶活性[13]，由此推測chSAMHD1 可能具有抗病毒作用。然而，目前缺乏商業(yè)化的chSAMHD1 抗體，這限制了對chSAMHD1 功能的研究。因此制備chSAMHD1多克隆抗體對于研究chSAMHD1 蛋白抗病毒功能和機制具有重要意義。

經蛋白理化性質預測，chSAMHD1 的SAM結構域不適于大腸桿菌原核表達系統(tǒng)的表達。因此，本試驗選擇chSAMHD1 的HD 結構域進行原核表達，并將其作為免疫原免疫BALB/c 小鼠以制備多克隆抗體。本試驗首先構建了 pETchSAMHD1 原核表達質粒，可溶性分析表明chSAMHD1 蛋白以包涵體的形式表達。將純化蛋白免疫BALB/c 小鼠制備抗chSAMHD1 蛋白的多克隆抗體，間接ELⅠSA 方法測定本研究制備的多抗效價可以達到1:256 000 以上，可以滿足后續(xù)試驗的需求。本試驗所制備的chSAMHD1 多克隆抗體為后期蛋白抗病毒功能的研究奠定了基礎。