李 靈，石翠翠，宋丙辰

（山東省武城縣畜牧漁業(yè)發(fā)展中心，山東 武城 253300）

禽流感是A 型流感病毒引起的以禽類為主的一種從呼吸系統(tǒng)到全身敗血癥等多種癥狀的傳染病，該病發(fā)病急、流行范圍廣、傳播速度快[1]。根據(jù)它的外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分為16 個(gè)H 亞型和9 個(gè)N 亞型，其中H5 和H7 兩個(gè)毒株對(duì)禽的危害比較大，蔓延比較快，可以造成禽大面積死亡，同時(shí)感染人的可能性也比較大，威脅人類的身體健康。近年來，禽流感病毒毒株變異比較快，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)禽業(yè)[2]，也有人感染禽流感的病例。為及時(shí)掌握免疫效果，武城縣畜牧漁業(yè)發(fā)展中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測人員對(duì)9 個(gè)養(yǎng)殖場進(jìn)行禽流感免疫抗體和病原學(xué)隨機(jī)采樣，并對(duì)免疫抗體監(jiān)測結(jié)果和病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行分析，以期為武城縣禽流感疫情防控、科學(xué)制定本縣的免疫方案及補(bǔ)免工作提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 禽流感血凝和血凝抑制（HA/HⅠ）抗原（H7 亞型和H5 亞型）均購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；通用型禽流感熒光PCR 病原試劑盒購自深圳真瑞生物科技有限公司；核酸提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器及耗材 熒光定量PCR 儀、核酸提取儀、生物安全柜、96 孔微量反應(yīng)板、振蕩器、微量移液器、PCR 反應(yīng)管。

1.1.3 主要樣品 按照隨機(jī)采樣的方式，根據(jù)《動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法》（NY/T 541-2002），對(duì)武城縣轄區(qū)內(nèi)9 個(gè)養(yǎng)殖場，包括2 個(gè)鴨場、1 個(gè)鴿場、6 個(gè)雞場進(jìn)行血樣抽檢，然后進(jìn)行血清學(xué)免疫抗體檢測；對(duì)轄區(qū)內(nèi)13 個(gè)養(yǎng)殖場點(diǎn)、1 個(gè)濕地野鳥棲息地、1 輛無檢疫證運(yùn)輸車上的雞進(jìn)行病原學(xué)檢測，主要用病毒采集管采集咽喉-泄殖腔拭子（野鳥棲息地采集野鳥的糞便）。采集后的樣品放入冷藏包4℃保存，當(dāng)天送往實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)室檢測方法，主要參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2020），采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)，對(duì)禽流感H7 亞型和H5 亞型進(jìn)行免疫抗體檢測和結(jié)果判定。根據(jù)《禽流感病毒RT-PCR 檢測方法》（NY/T 772-2013《禽流感病毒通用熒光RT-PCR 檢測方法》（GB/T 19438.1-2004），采用熒光定量PCR 的方法進(jìn)行禽流感病原學(xué)檢測。

1.2.1 血清學(xué)檢測 （1）血凝試驗(yàn)。在微量反應(yīng)板的1～4 排的1～12 孔均加入25 μL PBS；取25 μL H5 或H7 亞型抗原分別加入1～4 排的第1孔，混勻；從第1 孔吸取25 μL 抗原加入第2孔，混勻后吸取25 μL 加入第3 孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至第11 孔，從第11 孔吸取25 μL 棄之；每孔再加入25 μL PBS；每孔均加入25 μL 1%紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，在室溫下靜置40 min 后觀察結(jié)果。完全凝集（不流淌）的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU），根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4 HAU 的抗原。（2）血凝抑制試驗(yàn)。在微量反應(yīng)板的第1～11 孔均加入25 μL PBS，第12 孔加入50 μL PBS。取25 μL 待檢血清加入第1 孔內(nèi)，混勻后吸取25 μL 加入第2 孔，依次倍比稀釋至第10 孔，從第10 孔吸取25 μL 棄之；第1～11 孔均加入含4 HAU 混勻的病毒抗原液25 μL，混勻，室溫靜置 30 min；每孔均加入25 μL 1%紅細(xì)胞懸液,輕輕混勻，室溫下靜置40 min 后觀察結(jié)果。以完全抑制4 個(gè)HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HⅠ滴度?？贵w效價(jià)≥4 log2為陽性[3]。

1.2.2 病原學(xué)檢測 （1）樣品處理。將盛有拭子的病毒采集管劇烈渦旋振蕩1 min。（2）禽流感病毒RNA 的提?。喊春贾莶┤湛萍脊煞萦邢薰旧a(chǎn)的核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA 提取。將96 孔提取盒放于室溫，來回顛倒3 次去除塑膜板，進(jìn)行短暫離心，避免掛液，再撕去鋁箔膜，在96 孔板的第1 及第7 列孔加入300 μL病毒采集管的浸泡液，將96 孔提取盒放入核酸提取純化儀中，裝上磁棒保護(hù)套，進(jìn)行提取，程序過程見表1。

表1 禽流感病毒RNA 的提取程序

（3）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 操作：根據(jù)深圳真瑞生物科技有限公司生產(chǎn)的通用型禽流感熒光PCR病原試劑盒的操作方法進(jìn)行檢測，首先配制反應(yīng)體系：從試劑盒取出各組分，在室溫下融化并振蕩混勻后，2 000 rpm 離心5 s。設(shè)所需PCR 反應(yīng)管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照+1 管誤差預(yù)留量），配制見表2。其次是加樣：在上述制備好的PCR 反應(yīng)體系中分別加入處理好的陰、陽性對(duì)照和待測樣本RNA 各5 μL，終體積為25 μL/管，蓋好PCR 反應(yīng)管混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR 擴(kuò)增區(qū)，按照表3 反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)體系

表3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)程序

（4）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：試驗(yàn)陽性對(duì)照有典型S型擴(kuò)增曲線且Ct 值≤30，陰性對(duì)照Ct 值＞38 或無Ct 值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期則試驗(yàn)有效。如果檢測結(jié)果Ct 值＜35 且有明顯指數(shù)增長期則判為陽性；如果檢測結(jié)果Ct 值在35～38 范圍內(nèi)，需要進(jìn)行重新檢測，如果重新檢測結(jié)果Ct 值仍在35～38 范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判為陽性，否則為陰性；如果檢測結(jié)果Ct 值＞38 或無Ct 值則判為陰性[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果分析

血清學(xué)檢測結(jié)果顯示，武城縣禽流感H5 亞型免疫抗體合格率達(dá)到了100%，禽流感H7 亞型免疫抗體合格率達(dá)到了97.91%，表明禽流感免疫抗體合格率較高。

2.2 病原學(xué)檢測結(jié)果分析

該檢測方法檢測快，靈敏性和特異性比較高，在病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果上顯示14 個(gè)場點(diǎn)均為陰性，沒有出現(xiàn)陽性病例。說明武城縣家禽防疫工作扎實(shí)有效，并且養(yǎng)殖場戶的防疫意識(shí)有不同程度提高。

3 討論與結(jié)論

高致病性禽流感多發(fā)生在冬春季節(jié)，會(huì)導(dǎo)致禽大面積死亡，2023 年2 月柬埔寨有報(bào)道人感染禽流感H5N1 死亡的病例。本研究發(fā)現(xiàn)，武城縣禽流感免疫抗體合格率較高，這和武城縣規(guī)模養(yǎng)殖場按程序免疫，散養(yǎng)戶進(jìn)行春秋集中免疫，并嚴(yán)格落實(shí)每月補(bǔ)免制度是分不開的。群體免疫密度常年維持在90%以上，動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫疫苗采取規(guī)模養(yǎng)殖場“自行采購、先打后補(bǔ)”和散養(yǎng)戶“省級(jí)集中采購、調(diào)撥分發(fā)”相結(jié)合的方式保障。強(qiáng)制免疫的疫苗由疫苗廠家直接冷藏車運(yùn)輸?shù)娇h，再分發(fā)到防疫員，由防疫員用冷藏包分發(fā)養(yǎng)殖戶，或直接給養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的家禽注射上疫苗。這樣無論在運(yùn)輸環(huán)節(jié)還是儲(chǔ)存、使用環(huán)節(jié)，均充分保障了疫苗質(zhì)量和效果，確保了武城縣未發(fā)生禽流感疫情，保障了武城縣養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展。

雖然禽流感免疫抗體合格率均很高，但是在抗體效價(jià)上看，規(guī)?；B(yǎng)殖場禽的抗體效價(jià)高于散養(yǎng)禽抗體效價(jià)，規(guī)模場飼養(yǎng)時(shí)間長，經(jīng)驗(yàn)豐富，管理規(guī)范，堅(jiān)持按程序免疫，免疫密度達(dá)到100%，免疫主動(dòng)性相對(duì)較高。散養(yǎng)戶因防疫意識(shí)較為單薄，不能程序化免疫等因素，抗體水平參差不齊；蛋雞的抗體效價(jià)高于其他家禽抗體效價(jià)。

為做好武城縣的動(dòng)物疫情工作，不僅要加強(qiáng)從業(yè)人員的宣傳教育，包括養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理，屠宰場的清洗消毒；還應(yīng)加強(qiáng)禽類及其產(chǎn)品的產(chǎn)地檢疫，加大養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、運(yùn)輸環(huán)節(jié)的監(jiān)管，杜絕野鳥進(jìn)入動(dòng)物圈舍，降低禽流感病毒的感染風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)應(yīng)繼續(xù)定期加強(qiáng)禽流感抗體和病原學(xué)監(jiān)測[5]，防范禽流感在禽和人之間擴(kuò)散。只有這樣才能及時(shí)預(yù)警，盡早發(fā)現(xiàn)疫情，減少養(yǎng)殖場戶的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)維持無疫省狀態(tài)具有重要的意義。