袁英豪，嚴(yán)唯瑋，黃靜，李建龍，李琴，胡凱弟，劉愛平，劉書亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

大曲是我國(guó)白酒、食醋乃至整個(gè)釀造行業(yè)的重要原料之一[1-4]。大曲作為食醋固態(tài)釀造過(guò)程中的發(fā)酵劑和糖化劑（亦稱醋曲），包含了多種微生物及酶系，在合成醇、醛、酸、酮、酯等骨架化合物中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]，大曲發(fā)酵期間微生物代謝產(chǎn)物、風(fēng)味前體物質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的積累與形成對(duì)食醋品質(zhì)有顯著的影響[6-8]。

“曲是醋中骨”，醋曲中的霉菌主要源于自然環(huán)境富集，包括曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和犁頭霉（Absidia）等[5,9]，能產(chǎn)生液化酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶系，對(duì)原料中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等大分子進(jìn)行分解，使體系中糖類及氨基酸含量增加，分解產(chǎn)物可為食醋釀造微生物的代謝提供前體物質(zhì)，亦為后續(xù)食醋風(fēng)味形成奠定基礎(chǔ)[10-11]。王佳麗等[12]自山西老陳醋大曲中篩選得到一株高產(chǎn)糖化酶的黑曲霉，在麩皮培養(yǎng)基中酶活可達(dá)4 279.11 U/g，同時(shí)蛋白酶和纖維素酶活達(dá)到368.80、4 476.60 U/g，經(jīng)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件優(yōu)化后糖化酶提高了0.77倍。Liu A.P.等[13]為提高四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中淀粉的利用率，采用黑曲霉AS 3.758制得的醋曲強(qiáng)化麩醋發(fā)酵，表明黑曲霉的添加顯著提高淀粉利用率，同時(shí)，有機(jī)酸及游離氨基酸含量均得到顯著提高。Liu A.P.等[9]再以黑曲霉AS 3.758作為強(qiáng)化菌種，探究多輪生物強(qiáng)化對(duì)四川麩醋提高淀粉利用率的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，在多輪發(fā)酵中淀粉利用率平均提高9.8%。

芽孢桿菌（Bacillus）作為低豐度微生物在整個(gè)釀醋過(guò)程中始終存在，是發(fā)酵過(guò)程中重要功能菌[14-16]，不僅可產(chǎn)生多種水解酶，同時(shí)能夠合成吡嗪類風(fēng)味前體物質(zhì)[17]，如乙偶姻（3-羥基-2-丁酮，acetoin，ACT），本身具有愉悅的奶油香氣，目前對(duì)于高產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選多集中于地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）與枯草芽孢桿菌（B.subtilis）[18]。為提高和穩(wěn)定發(fā)酵產(chǎn)品中四甲基吡嗪（TTMP）含量，張潁等[19]自醬香型白酒大曲中篩選得到一株地衣芽孢桿菌GTBL-168，該菌株產(chǎn)乙偶姻含量為17.51 g/L。張玲玲等[20]從濃香型白酒大曲中篩選得到一株貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis），其乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到18.37 g/L。Xu B.Y.等[21]以接種地衣芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌制成強(qiáng)化大曲，研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)化大曲風(fēng)味物質(zhì)總含量高于傳統(tǒng)大曲，且大曲糖化力和酯化力增加，這與芽孢桿菌豐度的增加有關(guān)。

醋曲富含功能微生物菌群，是食醋釀造的重要菌種資源庫(kù)，其中的功能菌篩選于“曲”應(yīng)用于“醋”，一直是食醋釀造的重要課題。保寧麩醋是四川麩醋的典型代表，又是中國(guó)的四大名醋之一，從其自然發(fā)酵的“中藥醋曲”中獲得功能菌種并強(qiáng)化應(yīng)用是提升保寧麩醋產(chǎn)量與品質(zhì)的有效途徑之一。因此，本研究從“中藥醋曲”中篩選獲得優(yōu)良的產(chǎn)酸性糖化酶霉菌和產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌，優(yōu)化復(fù)合菌麩曲制備工藝，旨在為麩曲應(yīng)用提供菌種資源和數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

中藥醋曲樣品，采自四川保寧醋有限公司，分離獲得218株霉菌和128株芽孢桿菌，保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室；麩皮，市售；可溶性淀粉、肌酸、α-萘酚、無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

C1000 Thermal Cycler PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；UV1800PC紫外-可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；1300 Series A2生物安全柜，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；LDZX-40AI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療核子儀器廠；NLCD-307B光學(xué)顯微鏡，寧波永新光學(xué)股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(固/液）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基購(gòu)于海博生物公司。

麩皮培養(yǎng)基：市售普通粗麩皮與蒸餾水按1∶1比例混合均勻，于121 ℃高壓蒸料滅菌20 min，趁熱搖散后冷卻備用。

酸性糖化酶篩選培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉1%，瓊脂2%，溶解于蒸餾水，pH 4.5±0.1，115 ℃滅菌15 min。

V-P培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.05%，KH2PO40.5%，溶解于蒸餾水，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖12%，酵母浸粉0.5%，新鮮玉米漿1%，尿素0.2%，溶解于蒸餾水，115 ℃滅菌15 min。

孢子洗脫液：吐溫-80 0.2%，瓊脂粉0.1%，溶解于蒸餾水，121 ℃滅菌20 min。

改良O′Meara試劑：蛋白胨0.5%，肌酸0.3%，NaOH 40%，溶解于蒸餾水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)酸性糖化酶霉菌的篩選及鑒定

1.4.1.1 產(chǎn)酸性糖化酶霉菌的初篩

參照王佳麗[12]和倪海斌[22]方法。將醋曲中分離純化得到的霉菌點(diǎn)種于糖化酶篩選培養(yǎng)基（pH=4.5），經(jīng)28 ℃培養(yǎng)2～3 d，使用盧戈氏碘液對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行染色，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈，記錄透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值。

1.4.1.2 產(chǎn)酸性糖化酶霉菌的復(fù)篩

（1）麩曲制備將復(fù)篩霉菌于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，使用5 mL孢子洗脫液將孢子洗脫制得孢子懸液，取500 μL孢子懸液均勻接種于20 g麩皮培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d。每株霉菌做3次重復(fù)。

（2）麩曲糖化力的測(cè)定參照QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》[23]對(duì)糖化力進(jìn)行測(cè)定，單位為“U/g 干醅”。

1.4.1.3 產(chǎn)酸性生淀粉糖化酶霉菌的篩選

測(cè)定方法同1.4.1.2，以小麥淀粉替代麩曲中可溶性淀粉[24]。綜合考慮糖化力與生淀粉糖化力，選擇糖化力相對(duì)較高的霉菌作為后續(xù)試驗(yàn)用菌株。

1.4.1.4 產(chǎn)酸性糖化酶霉菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定參照文獻(xiàn)[25]和《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定參照李澤洋等[26]方法，對(duì)PCR擴(kuò)增及測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[27]。

1.4.2 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的篩選及鑒定

1.4.2.1 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的初篩

參照霍明月等[28]方法，挑取芽孢桿菌純菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)制得種子液，按1%（v/v）的接種量接種于V-P培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48 h，取菌懸液進(jìn)行離心，吸取1.0 mL上清液與1.0 mL改良O′Meara試劑混合均勻，37 ℃反應(yīng)1 h，觀察顏色變化，使用分光光度計(jì)測(cè)定520 nm處的光密度值，初步判斷各菌株產(chǎn)生乙偶姻的能力。

1.4.2.2 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的復(fù)篩

參照郭艷霞[29]和張玲玲等[20]的方法，按1%（v/v）的接種量接種芽孢桿菌種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48 h，離心取上清液100 μL，依次加入700 μL肌酸溶液（0.5%，w/v），1 mL α-萘酚（5%，w/v），1 mL KOH溶液（40%，w/v），振蕩均勻，60 ℃反應(yīng)10 min，測(cè)定樣品在OD520nm值。試驗(yàn)做3次重復(fù)。乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，乙偶姻溶液不同濃度與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.023 56x-0.011 24，R2=0.991 9。

1.4.2.3 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

（2）分子生物學(xué)鑒定參照Si J.等[30]方法，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建步驟同1.4.1.4。

1.4.3 霉菌與芽孢桿菌復(fù)配菌株的平板對(duì)峙試驗(yàn)

于LB固體培養(yǎng)基中央放置無(wú)菌牛津杯，并向其加入100 μL目標(biāo)芽孢桿菌菌懸液，同時(shí)將目標(biāo)霉菌孢子懸液對(duì)稱點(diǎn)接于牛津杯兩端，30 ℃正置培養(yǎng)2～3 d，觀察抑菌圈大小。

1.4.4 復(fù)合菌麩曲制備工藝優(yōu)化

1.4.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）種子液的制備同1.4.1.2、1.4.2.1方法制備種子液。

（2）霉菌與芽孢桿菌接種比例的確定以僅接種500 μL霉菌孢子懸液和僅接種500 μL芽孢桿菌菌懸液的麩曲處理組作為對(duì)照組；按比例1∶9、1∶1、3∶1、9∶1和99∶1接種霉菌孢子懸液和芽孢桿菌菌懸液的麩曲處理組為實(shí)驗(yàn)組，總接種量為1 mL；30 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行麩曲的霉菌孢子數(shù)、芽孢桿菌數(shù)和糖化力測(cè)定。

（3）復(fù)合菌麩曲培養(yǎng)溫度的確定按照霉菌、芽孢桿菌種子液最佳接種比例，總接種量為1 mL，在此水平下設(shè)置不同培養(yǎng)溫度梯度，分別于28、30、32、34和37 ℃，恒溫培養(yǎng)72 h后測(cè)定復(fù)合菌麩曲的霉菌孢子數(shù)、芽孢桿菌數(shù)和糖化力。

（4）復(fù)合菌麩曲培養(yǎng)時(shí)間的確定按照霉菌、芽孢桿菌種子液最佳接種比例，總接種量為1 mL，在此水平下設(shè)置不同時(shí)間培養(yǎng)梯度，分別于30 ℃恒溫培養(yǎng)40、48、60、72和96 h后對(duì)復(fù)合菌麩曲的霉菌孢子數(shù)、芽孢桿菌數(shù)、糖化力測(cè)定。

（5）霉菌和芽孢桿菌接種時(shí)間差的確定按照霉菌、芽孢桿菌種子液最佳接種比例，總接種量為1 mL，在此水平下設(shè)置不同接種方式，接種方式為先將霉菌孢子懸液接入到麩皮中，產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌菌懸液與霉菌接種時(shí)間間隔為0、12、24、36、48和60 h，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后進(jìn)行復(fù)合菌麩曲的霉菌孢子數(shù)、芽孢桿菌數(shù)和糖化力測(cè)定。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4.2 Box-Behnken響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇因素和水平，以霉菌孢子數(shù)、芽孢桿菌活菌數(shù)和糖化力為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法優(yōu)化制備復(fù)合菌麩曲的條件。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行計(jì)算，軟件SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸性糖化酶霉菌的篩選與鑒定

2.1.1 產(chǎn)酸性糖化酶霉菌的初篩情況

自醋曲源218株霉菌中篩選得到的水解淀粉能力相對(duì)較強(qiáng)的18株霉菌，其透明圈與菌落直徑比值均大于0.8（介于0.83～1.05）。

2.1.2 產(chǎn)酸性糖化酶霉菌的復(fù)篩情況

18株產(chǎn)酸性淀粉酶霉菌糖化力如圖1所示，SFM-1霉菌麩曲糖化力水平可達(dá)（2 524.15±120.00） U/g干醅，在初篩菌株中的糖化力水平突出，而SQM-18與SQM-14的麩曲糖化力水平次之，分別為（2 046.71±33.75）、（1 973.34±50.69） U/g干醅。選取其中糖化力水平較高的12株霉菌測(cè)定麩曲的生淀粉糖化力水平。

圖1 霉菌麩曲的酸性淀粉糖化酶活力Figure 1 Activity of acid glucoamylase in mouldy bran

2.1.3 產(chǎn)酸性生淀粉糖化酶霉菌的篩選情況

對(duì)12株霉菌麩曲的生淀粉糖化酶活力測(cè)定，測(cè)得SQM-14霉菌麩曲為12株霉菌麩曲中的生淀粉糖化酶活力最強(qiáng)，達(dá)到（333.53±14.15） U/g干醅，而SFM-1霉菌麩曲生淀粉糖化酶活力適中，為205.38±3.30 U/g干醅?？紤]到SFM-1產(chǎn)酸性糖化酶屬于較高水平[25,31]，且綜合霉菌麩曲的糖化力與生淀粉糖化力結(jié)果，選擇作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定與復(fù)配試驗(yàn)。

2.1.4 霉菌SFM-1的鑒定

霉菌SFM-1菌落形態(tài)特征如圖2（a～d）所示。培養(yǎng)初期，菌絲在培養(yǎng)基上匍匐生長(zhǎng)，呈白色；培養(yǎng)中期，菌絲遍布整個(gè)平板，呈棉絮狀；培養(yǎng)末期，菌落大而疏松并且菌絲頂端顏色逐漸加深，出現(xiàn)黑色孢子。霉菌SFM-1在光學(xué)顯微鏡（10 × 10）下的形態(tài)特征如圖2（e～f）所示。霉菌的匍匐菌絲清晰可見，有發(fā)達(dá)假根，孢囊梗無(wú)分支，孢子囊為球形黑色。由圖3知，霉菌SFM-1與米根霉（HQ897687.1、DQ119031.1、EU862186.1、DQ641279.1）同源性達(dá)到99%。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)判斷，確定SFM-1為米根霉。米根霉被認(rèn)為是安全的菌種（GRAS），具有較強(qiáng)的淀粉酶活力，能參與代謝酒精與蛋白質(zhì)[32]。

圖2 霉菌SFM-1不同時(shí)期的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)（100×）Figure 2 The colonial morphology and magnification morphology of SFM-1 at different times （100×）

圖3 SFM-1菌株基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 The phylogeny tree based on ITS sequence of strain SFM-1

2.2 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的篩選與鑒定

2.2.1 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的初篩情況

以V-P顯色反應(yīng)（Voges Proskauer反應(yīng)，V-P）為基準(zhǔn)，從醋曲源128株芽孢桿菌中篩選出了8株反應(yīng)明顯的菌株作為產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌復(fù)篩菌株：SAU-1、SAU-2、SAU-3、SAU-4、SAU-5、SAU-6、SAU-7、SAU-8，其OD520nm值在0.410～0.474。

2.2.2 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌的復(fù)篩情況

對(duì)8株芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中乙偶姻含量進(jìn)行測(cè)定。其中，SAU-1、SAU-4菌株產(chǎn)乙偶姻能力在初篩菌株中相對(duì)突出，乙偶姻產(chǎn)量分別為（15.296±0.334）、（14.018±0.312） g/L，在醋源菌株中少見報(bào)道[28]。因此選擇SAU-1、SAU-4進(jìn)行菌株鑒定并作為復(fù)配試驗(yàn)備用菌。

2.2.3 產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌SAU-1、SAU-4的鑒定結(jié)果

（1） 菌株SAU-1、SAU-4的形態(tài)特征

圖4是芽孢桿菌SAU-1、SAU-4在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征及顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)。二者菌落形態(tài)相似，菌落形狀均為圓形、微凸，表面存在褶皺，質(zhì)地呈膜狀，菌落顏色呈淡黃色（圖4A）。SAU-1、SAU-4菌株通過(guò)革蘭氏染色后在顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)均呈短桿狀且為紫色，說(shuō)明為革蘭氏陽(yáng)性菌；對(duì)2株菌進(jìn)行芽孢染色，觀察到呈紅色的菌體以及呈綠色的芽孢（圖4B）。

圖4A 芽孢桿菌SAU-1（a）、SAU-4（b）菌落形態(tài)Figure 4A Colonial morphology of SAU-1（a） and SAU-4（b）

（2） 菌株SAU-1、SAU-4的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

由圖5知，芽孢桿菌SAU-1、SAU-4與貝萊斯芽孢桿菌（MK203035.1、MT626060.1）同源性達(dá)到100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定SAU-1、SAU-4為貝萊斯芽孢桿菌。貝萊斯芽孢桿菌是2005年確定的芽孢桿菌新種[33]，能產(chǎn)生抗菌肽等抑菌物質(zhì)，具有良好的生物防治功能，同時(shí)可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等多種水解酶類，且安全性好，近年來(lái)常被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[34]。

圖5 芽孢桿菌SAU-1、SAU-4菌株基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 The phylogeny tree based on 16S rDNA sequence of bacillus SAU-1 and SAU-4

2.3 平板對(duì)峙試驗(yàn)

芽孢桿菌SAU-1、SAU-4與霉菌SFM-1在平板中生長(zhǎng)情況分別如圖6所示。由圖6（b）顯示，芽孢桿菌SAU-4與霉菌SFM-1存在明顯抑菌圈，圖6（a）顯示芽孢桿菌SAU-1與SFM-1幾乎不形成生長(zhǎng)抑制，判斷SAU-1與SFM-1間無(wú)拮抗作用。故初步選擇SAU-1與SFM-1為復(fù)配菌株。

圖6 芽孢桿菌SAU-1、SAU-4與霉菌SFM-1平板共生長(zhǎng)結(jié)果Figure 6 Co-cultivation results of SAU-1, SAU-4 and SFM-1 on PCA medium

2.4 優(yōu)化的復(fù)合菌麩曲制備工藝條件

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1.1 接種比例對(duì)復(fù)合菌麩曲的影響霉菌SFM-1與芽孢桿菌SAU-1接種比例對(duì)復(fù)合菌麩曲的影響如圖7（A）所示。結(jié)果顯示，芽孢桿菌活菌數(shù)隨SFM-1與SAU-1接種比例增大而出現(xiàn)減少趨勢(shì)；霉菌孢子數(shù)隨接種比例增大而出現(xiàn)先增多后減少的趨勢(shì)；在接種比例為9∶1時(shí)，麩曲中糖化力（3 090.89±130.02） U/g干醅，高于其他復(fù)配比例處理組（包括霉菌純種麩曲），說(shuō)明SFM-1與SAU-1在適宜的復(fù)配比例情況下有利于增強(qiáng)麩曲糖化活力。

圖7 不同培養(yǎng)條件對(duì)霉菌SFM-1與芽孢桿菌SAU-1制備復(fù)合菌麩曲效果的影響Figure 7 Effects of different culture conditions on bran Qu of compound bacteria prepared by SFM-1 and SAU-1

2.4.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)復(fù)合菌麩曲的影響

SFM-1與SAU-1以9∶1的復(fù)配比例接種于麩皮培養(yǎng)基中，不同培養(yǎng)溫度對(duì)復(fù)合菌麩曲的影響如圖7（B）所示。結(jié)果顯示，隨著溫度提升，麩曲中SFM-1霉菌孢子數(shù)和SAU-1活菌數(shù)均呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，SFM-1在以32 ℃條件培養(yǎng)時(shí)為最佳產(chǎn)孢溫度，SAU-1的活菌數(shù)在培養(yǎng)條件為34 ℃時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，麩曲中糖化力最高，為（3 049.71±273.85） U/g干醅。

2.4.1.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)復(fù)合菌麩曲的影響

SFM-1與SAU-1以9∶1的復(fù)配比例接種于麩皮培養(yǎng)基中，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)復(fù)合麩曲的影響如圖7（C）所示。結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，麩曲中SFM-1霉菌孢子數(shù)與SAU-1活菌數(shù)均呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后減少的趨勢(shì)；培養(yǎng)時(shí)間60 h，麩曲中SFM-1霉菌孢子數(shù)達(dá)到最大值，培養(yǎng)時(shí)間72 h，麩曲中SAU-1活菌數(shù)最大，并且，在該培養(yǎng)時(shí)間下，麩曲糖化力可達(dá)到（2 988.52±132.24） U/g干醅。

2.4.1.4 接種方式對(duì)復(fù)合菌麩曲的影響

SFM-1與SAU-1以9∶1的復(fù)配比例按不同接種時(shí)間接種于麩皮培養(yǎng)基中，得到霉菌SFM-1與芽孢桿菌SAU-1接種時(shí)間差對(duì)復(fù)合菌麩曲的影響結(jié)果。結(jié)果如圖7（D）所示，隨SFM-1與SAU-1接種間隔時(shí)間延長(zhǎng)，SFM-1霉菌孢子數(shù)和SAU-1活菌數(shù)整體均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，也一定程度上說(shuō)明SFM-1與SAU-1之間有促生長(zhǎng)作用。當(dāng)SFM-1與SAU-1接種時(shí)間相差48 h時(shí)，得到的麩曲中糖化力最高，為（3 416.81±83.01） U/g干醅。

2.4.2 Box-Behnken響應(yīng)面分析

2.4.2.1 響應(yīng)面分析的因素與水平

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析。合適的生物量是復(fù)合菌麩曲在醋醅發(fā)酵中發(fā)揮強(qiáng)化作用的基礎(chǔ)，而麩曲作為固態(tài)食醋釀造過(guò)程中的發(fā)酵劑和糖化劑，糖化力是衡量麩曲品質(zhì)重要指標(biāo)，因此以麩曲糖化力作為響應(yīng)面分析因素水平選擇主要依據(jù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 復(fù)合菌麩曲優(yōu)化的響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Response surface analysis factor level table of compound bran koji

2.4.2.2 響應(yīng)模型的構(gòu)建與檢驗(yàn)

麩曲優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用表2中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，確定霉菌孢子數(shù)與（A）、（B）、（C）、（D）的二元多項(xiàng)式回歸方程模型為：Y=-8.332×109+2.310A×108+2.241B×108+7.543C×108-3.822D×108-7.980AB×105-6.234AC×106-2.188AD×105-4.727BC×106-1.155BD×106+4.740CD×106+2.495A2×108-7.692B2×104-1.093C2×107+2.663D2×108；芽孢桿菌活菌數(shù)與（A）、（B）、（C）、（D）的二元多項(xiàng)式回歸方程模型為：Y=-1.888×1 011-4.827A×108+1.450B×109+1.656C×1010-4.111D×109+7.117AB×106-2.453AC×106+2.758AD×106-2.757BC×107-5.793BD×106+6.576CD×107+2.900A2×106-4.264B2×106-2.921C2×108+2.232D2×107；糖化力水平與（A）、（B）、（C）、（D）的二元多項(xiàng)式回歸方程模型為：Y=48 137.523+254.376A-2.362B-2295.966C-242.675D-2.132AB-3.263AC-2.466AD-0.380BC+0.484BD+2.550CD+5.619A2+9.709B2×10-3+32.165C2+1.355D2。根據(jù)回歸方程線性項(xiàng)系數(shù)可知，各因素對(duì)麩曲產(chǎn)孢能力、芽孢桿菌活菌數(shù)、糖化力的影響由大到小依次分別為：C>D>A>B、C>D>B>A、C>A>D>B。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of response surface test

方差分析結(jié)果（表略）表明，各響應(yīng)值試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂酗@著性（P<0.01或P<0.05），具體是：①霉菌孢子的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果為因素B、C、D、BC、BD、D2有顯著性；②芽孢桿菌數(shù)量的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果為因素B、C、D、B2、D2有顯著性；③糖化力的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果為因素C、AB、A2、D2有顯著性。各失擬項(xiàng)均不顯著（P>0.05），表明回歸方程與試驗(yàn)數(shù)據(jù)相配合，該回歸方程擬合得到的最優(yōu)條件是可靠的。

2.4.2.3 復(fù)合菌麩曲優(yōu)化條件的確定及驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面分析結(jié)果，綜合考慮麩曲中SFM-1孢子數(shù)、SAU-1活菌數(shù)以及麩曲糖化力三水平，得到復(fù)合菌麩曲的最優(yōu)制備方式：SFM-1與SAU-1接種比例為15∶1、接種間隔24 h、培養(yǎng)溫度為31 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為72 h。優(yōu)化條件后的復(fù)合菌麩曲中霉菌孢子數(shù)lg值為（8.94±0.05） 個(gè)/g、芽孢桿菌活菌數(shù)lg值為（9.78±0.17） CFU/g、糖化力為（3 388.56±82.62） U/g干醅，與模擬值中的霉菌孢子數(shù)lg值（9.27 個(gè)/g）、芽孢桿菌活菌數(shù)（10.17 CFU/g）、糖化力（3 512.61 U/g干醅）之間的相對(duì)偏差分別為3.56%、3.83%和3.52%，證明該模型可靠，同時(shí)驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型的合理性[35-36]。

3 結(jié)論

本研究從醋曲218株霉菌和128株細(xì)菌中初篩得到18株分解淀粉能力較強(qiáng)的霉菌及8株產(chǎn)乙偶姻能力較強(qiáng)的芽孢桿菌，在后續(xù)進(jìn)一步復(fù)篩中，并利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合的鑒定方法，同時(shí)與已有文獻(xiàn)比較，從醋曲中得到一株高產(chǎn)酸性糖化酶米根霉SFM-1和一株高產(chǎn)乙偶姻貝萊斯芽孢桿菌SAU-1，二者無(wú)拮抗作用。

利用單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合菌麩曲制備工藝，確定菌株SFM-1與SAU-1接種比例為15∶1、間隔接種時(shí)間為24 h、培養(yǎng)溫度為31 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，復(fù)合菌麩曲的生物量與糖化力可同時(shí)達(dá)到最佳水平，該培養(yǎng)條件下霉菌孢子數(shù)lg值、芽孢桿菌活菌數(shù)lg值、糖化力水平分別為：8.94 個(gè)/g、9.81 CFU/g、3 388.56 U/g干醅。本研究篩選得到一株高產(chǎn)酸性糖化酶米根霉和一株高產(chǎn)乙偶姻貝萊斯芽孢桿菌，并優(yōu)化出復(fù)合麩曲最佳制備工藝，可為大曲功能菌的開發(fā)與復(fù)合菌麩曲制備提供了數(shù)據(jù)參考。