楊敏,馬晶,楊舒婷,黃國虹,王昌敏(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心,烏魯木齊 830001)

Q熱(Q Fever)是一種由貝納特柯克斯體(Coxiella burnetii,Cb)引起的人畜共患病,人類Q熱的感染源主要是家畜(尤其是牛、羊)。該病原體以蜱為傳播媒介進行傳播并可以在動物體內經(jīng)卵傳代,從而形成自然疫源地[1]。流行病學數(shù)據(jù)顯示,該病人群總體患病率為10.2%(1 139/11 209)[2]。Cb在常規(guī)血培養(yǎng)中不生長,實驗室檢查方法主要為血清學檢測、PCR檢測、病原培養(yǎng)等[3]。目前我院尚未常規(guī)開展上述項目,當臨床出現(xiàn)相關病例時,極易被忽視,誤診率和漏診率較高。本研究通過采用宏基因組二代測序(metagenomic next generation sequencing,mNGS)技術輔助診斷急性Q熱并腦膜腦炎1例,報道如下。

1 病歷資料

患者男,28歲,無業(yè),因“發(fā)熱5 d”于2022年6月27日就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院(以下簡稱“我院”)。患者5 d前高溫勞作后出現(xiàn)頭痛、發(fā)熱,體溫最高39 ℃,自行口服抗生素后,頭痛緩解,但仍有發(fā)熱、乏力,伴惡心、嘔吐1次,嘔吐物為胃內容物,有腹脹、納差,否認腹痛、腹瀉,發(fā)熱病區(qū)以“發(fā)熱待查”收治入院?；颊咂剿伢w健,既往有神經(jīng)性皮炎病史,家族史、婚育史均無特殊,否認近期疫區(qū)流行病學史及牲畜接觸史。入院查體:體溫38.2 ℃;脈搏104次/分;呼吸23次/分;血壓128/96 mmHg,心肺未見明顯異常,神經(jīng)系統(tǒng)查體未見明顯陽性體征。血常規(guī)示:白細胞7.01×109/L,中性粒細胞百分比76.70%,C反應蛋白72.93 mg/L;血沉28.00 mm/h;肝功能指標結果:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)75.00 U/L、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)60.00 U/L、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)160.00 U/L。肺部CT未見明顯異常,頭顱MR示雙側軟腦膜可疑強化,其余檢查無特殊。入院次日患者突發(fā)譫妄并出現(xiàn)自殺行為,送檢外周血及腦脊液mNGS檢測后提示Cb感染,經(jīng)規(guī)范化治療后患者病情明顯好轉,未再發(fā)熱,未再出現(xiàn)譫妄、神經(jīng)癥狀,復查肝功能指標較前有所下降,無特殊不適主訴,故于2022年7月14日出院,院外繼續(xù)口服多西環(huán)素片21 d、口服保肝藥物,監(jiān)測肝功能,定期復查。

2 實驗室檢查方法及結果

2.1標本采集及前處理

2.1.1外周血采集及前處理 在患者接受抗生素治療前采血,并盡可能在寒戰(zhàn)或開始發(fā)熱時采血。選擇游離DNA保存管或EDTA-K2抗凝管,隨機采集患者靜脈血3～5 mL,抽血時避免溶血。采血后立即輕輕顛倒混勻8～10 次,避免凝固,混勻時動作不能太劇烈,防止溶血。8 h內將采血管置于4 ℃、4 000 r/min離心10 min,取300 μL血漿,使用核酸提取或純化試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)進行血漿DNA提取。

2.1.2腦脊液采集及前處理 征得患者同意后,由臨床醫(yī)師采集腦脊液2 mL,立即送檢。取600 μL腦脊液加入7.2 μL溶壁酶進行酶破壁反應,在0.5 mm玻璃珠(250 μL)中進行物理破壁,混合震蕩20 min后收集300 μL樣本,使用核酸提取或純化試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)進行腦脊液DNA提取,檢測濃度后使用基因組DNA片段化試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)進行酶切反應,酶切產(chǎn)物備用。其余樣本置于-70 ℃儲存6個月以備復查,應避免反復凍融。

2.2mNGS檢測及結果 將以上兩種標本同時進行下述檢測流程,按照DNA核酸檢測試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)說明書設置合適的溫度和循環(huán)數(shù)進行末端修復(37 ℃ 10 min;65 ℃15 min)、接頭連接(23 ℃ 20 min)、PCR擴增(98 ℃ 2 min; 98 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共12個循環(huán);72 ℃ 5 min)、純化等一系列步驟,使用Qubit 4熒光儀及Qubit ds DNA HS Assay Kit(美國賽默飛世爾科技有限公司)檢測PCR純化產(chǎn)物(即文庫)的濃度。按照檢測后的PCR濃度將構建好的文庫按等質量進行pooling,將pooling混合后的文庫經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結構,再經(jīng)滾環(huán)復制生成DNB納米球。制備好的DNB納米球加載至測序芯片,使用MGISEQ-2000基因測序儀(武漢華大智造科技有限公司)進行測序[4]。測序數(shù)據(jù)下機后去除低質量的序列以獲得高質量的數(shù)據(jù)。通過BWA軟件比對將高質量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除[5]。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復雜度序列后與武漢華大生物科技有限公司自主研發(fā)的PMDB病原數(shù)據(jù)庫(包括6 350種細菌、1 064種真菌、4 945種病毒、234種寄生蟲)進行比對,獲得病原微生物的鑒定結果,并自動生成檢測報告及各類病原體檢出列表。

7月3日,患者血漿mNGS報告檢出Cb,嚴格比對序列數(shù)14,相對豐度36.56%,覆蓋率0.027 1%,基因組覆蓋分布圖見圖1。患者腦脊液mNGS報告未檢出任何病原體。

注:覆蓋率,檢測到的該菌核酸序列長度占該菌整個基因組序列長度的百分比;橫坐標為檢測到的該菌核酸序列在該菌整個基因組上的位置;縱坐標為每個位置上檢出該菌的序列數(shù)。圖1 Cb的基因組覆蓋分布情況

3 討論

針對發(fā)熱待查患者的診斷,檢驗科一直以來都扮演著非常重要的角色,從最基礎的血尿便常規(guī)檢查、生化檢測、微生物培養(yǎng)、分子檢測,到近年來應用廣泛的宏基因組二代測序技術[6],均為臨床的診斷提供了許多線索。在本案例中,患者為青年男性,急性起病,高熱不退,完善相關檢查后,自身免疫病、腫瘤性疾病、血液系統(tǒng)疾病診斷依據(jù)不足,遂考慮感染性疾病可能性大?；颊呒韧鶡o神經(jīng)系統(tǒng)器質性問題、器質性精神障礙等病史,病程中突發(fā)譫妄并出現(xiàn)自殺行為,考慮中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。常規(guī)實驗室檢查均未明確感染源,患者病情重且進展快,故而送檢外周血及腦脊液進行宏基因組二代測序。

本次研究在血漿中檢出Cb序列14條,樣本建庫濃度合格,且在基因組覆蓋分布圖上可看到序列分布比較分散,代表Cb整個基因組不同位置均檢測到有效序列;此外,回看檢出的其他微生物列表,均為背景菌或定植菌,未關注到其他可疑致病菌,結果較為可信。腦脊液mNGS結果報告為陰性。將結果反饋給臨床后,醫(yī)生追問患者病史,患者在烏魯木齊市南山居住長達1年,該地山林環(huán)繞,存在大量蜱蟲,不排除患者被叮咬或接觸含Cb氣溶膠的可能,為Q熱易感人群,結合患者流行病學史、臨床癥狀、體征及二代測序檢測結果,考慮診斷為急性Q熱。病程中患者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,頭顱MRI軟腦膜可疑強化,存在腦膜腦炎,雖腦脊液二代測序未檢出有效序列,但患者用藥后癥狀明顯改善,神志轉清,精神好轉,仍考慮為Q熱所致無菌性腦膜腦炎。

綜上所述,本研究通過mNGS輔助診斷了1例急性Q熱伴腦膜腦炎的患者,提示當臨床出現(xiàn)不明原因發(fā)熱的患者,且常規(guī)檢驗未能明確感染源時,可考慮行二代測序進行輔助診斷,為臨床醫(yī)生在缺乏有效診斷依據(jù)時提供新思路;對于高熱伴肝酶異常、出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的患者,常規(guī)抗感染、抗病毒治療無效時,不應忽視Q熱的篩查。