孫瑗敏,譚欣,鄭力勝,張蓓,楊小慧,于洋,李會強(.天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院,天津 30003;.天津市兒童醫(yī)院檢驗科,天津 300074)

雞蛋是嬰幼兒最早攝入的食物之一,雞蛋過敏(egg allergy,EA)是全球嬰幼兒及兒童最常見的一種食物過敏現(xiàn)象[1]。據(jù)估計,5歲以下兒童的雞蛋過敏患病率在1.8%～2%之間,雞蛋過敏兒童最常見的癥狀是由IgE介導的變態(tài)反應所致,在極少數(shù)的情況下,患者也會因雞蛋過敏而引起致命的反應。

單組分解析診斷(component-resolved diagnostic,CRD)是檢測過敏食物中單一蛋白質(zhì)分子的特異性IgE抗體(specific IgE,sIgE),也可理解為過敏原sIgE抗體譜的檢測。雞蛋蛋清比蛋黃含有更多的致敏蛋白,包括20多種不同的蛋白質(zhì)和糖蛋白,其中卵類黏蛋白(ovomucoid,OVM,Gal d1,約占11%)、卵白蛋白(ovalbumin,OVA,Gal d2,約占45%)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin,OVT,Gal d3,約占12%)和溶菌酶(lysozyme,Lsy,Gal d4,約占3%)4種蛋白質(zhì)已被確定為主要過敏原[2]。不同組分蛋白質(zhì)具有不同的特性,如Gal d1由于其熱穩(wěn)定性和蛋白酶的存在,使其與熟雞蛋過敏以及由此引起的持續(xù)過敏現(xiàn)象相關;Gal d2與Gal d1相比,具有更強的熱不穩(wěn)定性,故其與未煮熟的雞蛋過敏相關。因此,雞蛋過敏的組分診斷從方法學上會更準確,從臨床應用角度也更契合“精準診斷、精準治療、精準預防”的宗旨[3]。本課題組在前期建立光激化學發(fā)光分析(light-initiated chemiluminescence assay,LiCA)蛋清組分檢測方法的基礎上[4],對雞蛋過敏患者進行蛋清4種主要過敏原組分蛋白sIgE抗體譜檢測,力求獲得sIgE抗體譜的分布特征,以期明確雞蛋組分診斷的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1研究對象 收集2021年5月至2022年5月就診于天津市兒童醫(yī)院消化科的雞蛋過敏患者血清樣本197例。其中男性118例,女性79例,年齡0～16歲。納入標準:(1)符合IgE介導的雞蛋過敏臨床診斷標準[5],即攝入雞蛋或雞蛋制品后數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)出現(xiàn)令人信服的過敏反應(定義為蕁麻疹、呼吸困難、喘息、嘔吐、腹瀉甚至過敏性休克等癥狀),再次進食同種食物后,癥狀重復出現(xiàn)或雞蛋皮膚點刺試驗反應呈陽性,或兩者兼有?？紤]到存在發(fā)生嚴重過敏反應的潛在風險,未進行口服激發(fā)試驗。(2)雞蛋sIgE抗體陽性(≥0.35 kUA/L)。排除標準:(1)診斷為非IgE介導的雞蛋過敏,主要表現(xiàn)為遲發(fā)的胃腸道癥狀。(2) 無完整病歷資料。另收集同期就診的陰性對照血清樣本6例,均為無過敏癥狀的健康兒童[6],其中男性2例,女性4例,年齡2～12歲。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號:TMUHMEC2017008),患兒家屬知情同意。

1.1.2主要儀器和試劑 高通量LiCA檢測儀(上海博陽生物科技有限公司),科瑞迪全自動酶免儀(HB-500E)購自嘉興科瑞迪醫(yī)療器械有限公司,發(fā)光微球及鏈霉親合素包被的感光微球(北京科美診斷技術有限公司)。蛋清單組分過敏原卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶(美國Sigma-Aldrich公司),生物素化山羊抗人IgE抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司),過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒(江蘇浩歐博生物制藥有限公司)。

1.1.3抗原包被發(fā)光微球 取適量的發(fā)光微球用超純水洗滌數(shù)次,用0.05 mol/mL 碳酸氫鹽緩沖液(CBS,pH 9.6)重懸后取適量發(fā)光微球,分別與Gal d1、Gal d2、Gal d3、Gal d4抗原以質(zhì)量比為8∶1混合,37 ℃ 震蕩過夜,經(jīng)還原、封閉后,超純水洗滌以去除游離的抗原,最后加入發(fā)光微球保存液100 μL[20 mmol/L 4-(2-羥乙基) -1-哌嗪乙磺酸鹽緩沖液HEPES、2 g/L 牛血清白蛋白BSA、0.1% ProClin300],調(diào)節(jié)終濃度至10 mg/mL,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1蛋清sIgE抗體檢測 蛋清sIgE抗體檢測采用酶聯(lián)免疫捕獲法,按照符博克sIgE檢測試劑及科瑞迪全自動酶免儀(HB-500E)說明書檢測。結(jié)果判讀與分級遵照國際標準[7]:0級,0～0.35 kUA/L;1級,0.35～0.70 kUA/L;2級,0.70～3.50 kUA/L;3級,3.50～17.50 kUA/L;4級,17.50～50.00 kUA/L;5級,50.00～100.00 kUA/L;6級,>100.00 kUA/L。以≥1級為陽性。

2 結(jié)果

2.1蛋清sIgE抗體檢測結(jié)果 本研究采用商品化試劑對197例蛋清過敏患兒樣本進行蛋清sIgE抗體檢測,具體sIgE等級及樣本例數(shù)見表1。

表1 血清樣本分級表

2.2雞蛋過敏組分sIgE抗體陽性比例 采用LiCA技術檢測197例雞蛋過敏患兒血清,蛋清4種組分sIgE抗體檢測結(jié)果見圖1。其中139例(70.56%)患兒血清中含有卵類黏蛋白sIgE抗體,152例(77.16%)患兒血清中含有卵白蛋白sIgE抗體,69例(35.02%)含有卵轉(zhuǎn)鐵蛋白sIgE抗體,36例(18.27%)患兒血清中含有溶菌酶sIgE抗體,另有45例蛋清過敏患兒未檢測出4種組分sIgE抗體。其中,卵類黏蛋白和卵白蛋白為主要的過敏蛋白。

注:A,蛋清4種組分sIgE陽性比例;B,1～4種組分過敏陽性比例。圖1 血清卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶抗體檢出比例

在197例患兒血清中,22例(11.17%)僅含1種組分的sIgE抗體,67例(34.01%)同時含有蛋清4種組分中2種組分的sIgE抗體,46例(23.35%)同時含有蛋清4種組分中3種組分的sIgE抗體,22例(11.17%)同時含有蛋清4種組分的sIgE抗體,其中同時含有蛋清4種組分中的2種組分抗體的患兒人數(shù)最多。

2.3蛋清4種組分sIgE抗體表達水平 采用LiCA技術檢測197例雞蛋過敏患兒血清,如圖2所示,其中患兒血清中卵類黏蛋白的sIgE抗體S/N高值分布較多,最高可達87.83,即表達水平最高,而多數(shù)溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的sIgE抗體S/N較低,溶菌酶sIgE抗體S/N最高僅為44,患兒體內(nèi)抗體量及表達水平均較低。

圖2 LiCA法檢測血清中蛋清4種組分sIgE抗體的表達水平

2.4蛋清4種組分sIgE抗體表達模式 蛋清組分sIgE抗體表達存在顯著個體差異性。在197例過敏患兒檢測中,對卵類黏蛋白和卵白蛋白這一組合過敏的患兒人數(shù)最多,占所有樣本的30.46%(60例),并且陽性率最高的4種模式中對每種組合過敏的患兒血清中均含有卵類黏蛋白sIgE抗體和卵白蛋白sIgE抗體,其中血清中含有溶菌酶sIgE抗體的患兒均含有1種或2種其余蛋清組分的sIgE抗體,并未檢出單獨對溶菌酶此種組分過敏的患兒(表2),有22例(11.17%)同時含有蛋清4種組分sIgE抗體(表3)。

表2 蛋清過敏組分sIgE抗體表達模式

表3 陽性率最高的4種致敏模式

2.5蛋清4種組分sIgE抗體水平與血清雞蛋sIgE抗體的關系 將每位患兒4種組分sIgE抗體S/N值累加,與臨床檢測所得的雞蛋sIgE抗體濃度進行相關性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者具有相關性,但r=0.266 8,P<0.05,相關程度較弱 (圖3A)。此外,不同的患兒對4種組分的過敏強度具有明顯的個體差異(圖3B)。

注:A,蛋清4種組分sIgE與雞蛋sIgE相關性分析;B,患者蛋清4種組分sIgE強度分布。圖3 患兒血清中混合組分sIgE抗體和4種單一組分sIgE抗體總和的相關性分析

3 討論

目前,臨床對雞蛋過敏患兒的診斷主要依靠血清過敏原特異性IgE抗體水平,但是由于蛋清中含有23種致敏性或非致敏性的蛋白質(zhì),故其采用的天然變應原粗提物由于純度不夠,雜質(zhì)較多,有時會導致假陽性結(jié)果,除此之外,單組分解析診斷對雞蛋過敏患兒進行精準診斷具有重要的意義。

LiCA方法已被證實在過敏原sIgE檢測時,其分析性能滿足臨床要求[8],此方法是一種基于兩種微球之間發(fā)生氧化還原反應的免疫學分析方法,其具有高敏感性、高通量、檢測迅速等優(yōu)點,并且已被用于多種物質(zhì)的檢測?；诖朔椒ㄒ呀?jīng)成功建立了雞蛋、牛奶、艾蒿、屋塵螨和貓皮屑過敏原的檢測體系[9-13],故而本研究基于LiCA法對蛋清過敏4種組分sIgE進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Gal d1和Gal d2的陽性反應率分別為70.56%和77.16%,明顯高于其他組分,與國內(nèi)外報道結(jié)果一致[14-17];30.45%的患兒對Gal d1和Gal d2同時過敏[18],整體來看,Gal d1的陽性強度較高,但是對Gal d2過敏的患兒人數(shù)最多,此結(jié)果與多項研究結(jié)果相符合,即亞洲地區(qū)陽性率最高的組分是Gal d2[19]。然而,另一項研究顯示,在歐洲Gal d1 sIgE≥3.7 kUA/L是診斷兒童雞蛋過敏最佳的臨界值,Gal d1 sIgE有助于區(qū)分臨床反應性雞蛋過敏患者和對加熱雞蛋耐受的患者,并且在不同年齡的人群之間沒有明顯的差異;而診斷患兒對生雞蛋過敏最佳的臨界值為Gal d2 sIgE≥2.01 kUA/L[20]。因此針對Gal d1陽性強度高于Gal d2的原因可能是對Gal d1過敏的患者較多,受試者的年齡范圍不同,以及食入雞蛋的時間不同和種族的差異等。本研究發(fā)現(xiàn)有22.3%的患兒未檢測到蛋清4種組分sIgE抗體,同時患者蛋清4種組分sIgE的累積含量與雞蛋粗提物的sIgE含量相關程度較弱,原因可能是雞蛋含有較多的組分,而此次研究主要關注了蛋清4種組分,其中未涉及到的其他雞蛋組分。有研究表明部分雞蛋過敏患兒對蛋黃中的血清白蛋白(Gal d5)[21]和YGP42 (Gal d6)較敏感[22]。同時,商品化的試劑檢測雞蛋sIgE含量主要采用的是天然變應原粗提物,其純度不夠,雜質(zhì)較多,有時也會導致部分假陽性的結(jié)果。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)雞蛋sIgE抗體和蛋清4種組分sIgE抗體之間相關性較弱,且每種成分的致敏性差異較大,原因可能是由于本研究所使用的是蛋清4種組分純品抗原,其主要是基于單一組分sIgE抗體的檢測,而臨床上檢測雞蛋過敏的商品化試劑采用的是雞蛋粗提取物,其中不同的組分之間可能存在相互干擾。此外,也有部分雞蛋組分在本研究中未涉及到。但是,本研究顯示雞蛋過敏的部分患兒其蛋清各組分sIgE抗體水平具有明顯的個體差異。因此,雞蛋組分檢測可對雞蛋過敏患兒的診斷和預防起到一定的輔助作用。在臨床診斷過程中,對于嬰幼兒來說雞蛋是一種不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì),而目前避免雞蛋過敏的主要方法就是回避雞蛋的食用,這對于患兒及其家屬而言均是較困難的。因此,通過過敏原單組分解析可明確誘發(fā)雞蛋過敏的具體組分,既可以提高診斷的準確性,也可為更精確的脫敏和更個性化的飲食提供參考依據(jù)[23]。