劉金,曹相婷,崔榮淑,徐小飛,董召剛(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 .婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心,.檢驗(yàn)科,濟(jì)南 250012)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion, RSA)發(fā)生率為1%～5%[1],目前尚無有效的診斷標(biāo)志物。因此,尋找靈敏度及特異性較高的標(biāo)志物診斷RSA是臨床亟待解決的難題。環(huán)狀RNAs(circRNAs)是一類內(nèi)源性共價(jià)閉合的單鏈RNA,通過miRNA海綿、調(diào)控基因表達(dá)等方式發(fā)揮作用。研究表明,circRNAs與多種妊娠相關(guān)疾病密切相關(guān),其在發(fā)生RSA時(shí)呈異常表達(dá),并通過ceRNA機(jī)制參與RSA的發(fā)生、發(fā)展[2]。circRNAs可富集于細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),在胃癌、肺癌等多種疾病中呈異常表達(dá),是潛在的診斷標(biāo)志物。趙婷等[3]發(fā)現(xiàn),循環(huán)circRNAs能夠穩(wěn)定存在于血液等體液中,具有組織/細(xì)胞特異性和廣泛表達(dá)等特點(diǎn),在發(fā)生肺癌時(shí)的表達(dá)水平顯著變化,可作為診斷、療效監(jiān)測標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。hsa_circ_0005075是新近發(fā)現(xiàn)的circRNA分子,其在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá),并可以促進(jìn)腫瘤增殖和侵襲[4]。但目前血清EVs hsa_circ_0005075在RSA中的表達(dá)及診斷價(jià)值國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究旨在分析EVs hsa_circ_0005075在RSA患者血清中的表達(dá)水平,以期評(píng)價(jià)其在RSA中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2021年5月至2023年3月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的14例女性RSA患者和14例正常妊娠者(對(duì)照組)為訓(xùn)練集,64例RSA患者和48例對(duì)照作為驗(yàn)證集。RSA組年齡22～37歲,中位年齡為30歲,其中流產(chǎn)次數(shù)3次及以上的年齡22～37歲,中位年齡為30歲,流產(chǎn)次數(shù)2次的年齡21～37歲,中位年齡為30歲;正常妊娠對(duì)照組年齡19～40歲,中位年齡為30歲。RSA的診斷依據(jù)《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治中國專家共識(shí)(2022)》[5]。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡>18歲;(2)夫妻染色體核型正常;(3)生殖系統(tǒng)發(fā)育正常;(4)至少連續(xù)2次早孕期自然流產(chǎn);(5)2個(gè)月內(nèi)未使用抗凝或者促纖溶藥品、激素或者免疫抑制劑;(6)距上次流產(chǎn)3個(gè)月及以上,就診時(shí)處于未孕狀態(tài);(7)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)因其他原因主動(dòng)流產(chǎn)者;(2)患有糖尿病、心血管疾病或免疫系統(tǒng)疾病等;(3)2個(gè)月內(nèi)使用抗凝或者促纖溶藥品、激素或者免疫抑制劑;(4)生殖器官畸形或感染;(5)臨床資料不完整。對(duì)照組為經(jīng)B超和HCG確診處于妊娠早期者,均無自然流產(chǎn)史,無糖尿病、自身免疫病等全身性疾病。本研究經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[(科)倫審第2021048號(hào)],各研究對(duì)象及家屬知情同意。

1.2標(biāo)本采集 采集各研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL于含有分離膠/二氧化硅添加劑真空采血管中,3 000×g離心10 min,分離血清,用1.5 mL Ep管分裝,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3儀器及試劑 QuantStudioTM5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國ABI公司),Cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀(德國羅氏診斷公司),Bio-FLASH全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國依諾瓦診斷公司),XW-80A渦旋震蕩器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司),Nanodrop One超微量紫外可見光分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)。甲狀腺球蛋白抗體(antithyrocyte globulin,A-TG)、抗甲狀腺過氧化物酶自身抗體(thyroid peroxidase antibody,A-TPO)檢測試劑盒購自德國羅氏診斷公司,抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody,ACA)、抗β2糖蛋白1抗體(anti-β2 glycoprotein 1 antibody,anti-β2GP1Ab)檢測試劑盒購自美國依諾瓦診斷公司,exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit購自德國Qiagen公司,Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒、Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.4血清A-TG、A-TPO、ACA、抗β2GP1抗體檢測 RSA患者及正常妊娠血清A-TG、A-TPO濃度采用電化學(xué)發(fā)光法檢測,ACA(IgA、IgG、IgM)、抗β2GP1抗體(IgA、IgG、IgM)濃度采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測,操作嚴(yán)格按照儀器及試劑說明書進(jìn)行。A-TPO參考區(qū)間為0～34 IU/mL,A-TG參考區(qū)間為0～115 IU/mL,ACA(IgA)參考區(qū)間為0～4.2 CU,ACA(IgG)參考區(qū)間為0～14.5 CU,ACA(IgM)參考區(qū)間為0～7 CU,抗β2GP1抗體(IgA)參考區(qū)間為0～4 CU,抗β2GP1抗體(IgG)參考區(qū)間為0～7.4 CU,抗β2GP1抗體(IgM)參考區(qū)間為0～3.6 CU。

1.5血清EVs hsa_circ_0005075檢測

1.5.1RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照參考文獻(xiàn)[6],利用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取血清EVs中RNA,使用Nanodrop One超微量紫外可見光分光光度計(jì)測量每份樣本的RNA濃度。取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn),樣本置于-80 ℃保存。按照Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,樣本置于-20 ℃保存。

1.5.2引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR hsa_circ_0005075引物采用cricPrimer1.2軟件設(shè)計(jì),來源于circbase數(shù)據(jù)庫(ID為hsa_circ_0005075),引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。hsa_circ_0005075上游引物序列:5′-CCCCTGGACTCTCTCAAAATTC-3′,下游引物序列:5′-GTCTTGCCACTTGTGTTACCG-3′;退火溫度60 ℃,產(chǎn)物大小為112 bp,18S引物來源于本課題組前期研究[7],上游引物序列:5′-AGGGACAAGTGGCGTTCAGC-3′,下游引物序列:5′-CGGACATCTAAGGGCATCAC-3′,退火溫度60 ℃,產(chǎn)物大小為187 bp。PCR擴(kuò)增使用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括10 μmol/L Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,cDNA 2 μL,無菌超純水補(bǔ)足體積。PCR循環(huán)參數(shù):95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃退火/延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。于60～95 ℃(0.15 ℃/s)用儀器自帶軟件采集熒光信號(hào)并進(jìn)行分析,采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,以18S為內(nèi)參照。公式:ΔΔCt=[(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。

2 結(jié)果

2.1血清EVs hsa_circ_0005075的表達(dá)水平 K-S檢驗(yàn)結(jié)果顯示,各組數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布(P<0.05)。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)結(jié)果顯示,在訓(xùn)練集中,RSA組血清EVs hsa_circ_0005075的相對(duì)表達(dá)量為7.69(4.74,42.15),顯著高于對(duì)照組的1.02(0.51,4.23),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=28,P<0.01)。而在驗(yàn)證集中,RSA組血清EVs hsa_circ_0005075的相對(duì)表達(dá)量為4.96(1.73,8.89),亦顯著高于對(duì)照組的1.00(0.24,2.96),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=693,P<0.01)。此外,hsa_circ_0005075在流產(chǎn)3次及以上RSA患者中的相對(duì)表達(dá)量為7.50(1.32,17.69),雖然高于流產(chǎn)2次患者的4.76(1.74,8.23),但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=308,P>0.05)。

2.2血清 EVs hsa_circ_0005075在RSA患者不同臨床病理參數(shù)中的表達(dá) 血清EVs hsa_circ_0005075的表達(dá)與RSA患者年齡、體重指數(shù)、月經(jīng)周期、痛經(jīng)等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 血清EVs hsa_circ_0005075在RSA患者不同臨床病理參數(shù)中的表達(dá)[M(P25,P75)]

2.3ROC曲線分析結(jié)果 以RSA為疾病組,正常妊娠者為對(duì)照組,血清EVs hsa_circ_0005075鑒別診斷RSA組和對(duì)照組的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.774(95%CI:0.686～0.848),當(dāng)cut-off值為2.468時(shí),其敏感性為70.3%,特異性為75.0%(圖1)。

圖1 血清EVs hsa_circ_0005075鑒別診斷RSA和正常妊娠的ROC曲線

2.4血清EVs hsa_circ_0005075與RSA患者A-TPO、A-TG、ACA、抗β2GP1抗體的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,血清EVs hsa_circ_0005075的表達(dá)水平與RSA患者A-TPO的表達(dá)水平相關(guān)(r=0.298,P<0.05),而與A-TG(r=0.042,P>0.05)、ACA[IgA(r=0.199,P>0.05)、IgG(r=-0.165,P>0.05)、IgM(r=-0.089,P>0.05)]、抗β2GP1抗體[IgA(r=0.188,P>0.05)、IgG(r=0.163,P>0.05)、IgM(r=0.017,P>0.05)]等的表達(dá)水平均無關(guān)。

3 討論

Hsa_circ_0005075位于chromosome 1:2137735821415706,在結(jié)直腸癌和肝癌中表達(dá)上調(diào)[4,8],但其在RSA患者中的表達(dá)尚不清楚。本研究檢測了RSA組和正常妊娠組中血清EVs hsa_circ_0005075的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)血清EVs中hsa_circ_0005075在RSA組中的表達(dá)水平高于正常妊娠組,提示血清EVs hsa_circ_0005075是潛在的新型標(biāo)志物,對(duì)鑒別診斷RSA和正常妊娠具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

早期文獻(xiàn)報(bào)道[9],hsa_circ_0005075能夠通過下調(diào)SIRT1的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖和轉(zhuǎn)移,發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果顯示,血清EVs hsa_circ_0005075與年齡、BMI指數(shù)、月經(jīng)規(guī)律、痛經(jīng)、流產(chǎn)次數(shù)等不相關(guān),而這些因素與RSA的發(fā)病及進(jìn)展息息相關(guān)。這提示hsa_circ_0005075可能與RSA患者的卵巢功能減退、胚胎著床穩(wěn)定性下降、內(nèi)膜容受性下降等無顯著關(guān)聯(lián)。分析原因可能是hsa_circ_0005075僅作為RSA的標(biāo)志物,不參與疾病進(jìn)展;或者該分子在不同的組織中發(fā)揮的作用不同;也可能是由于樣本量較小,沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往流產(chǎn)次數(shù)是RSA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加,再次流產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)將顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005075在流產(chǎn)3次及以上RSA患者中的表達(dá)水平高于流產(chǎn)2次的患者,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析原因可能是樣本量不足所致,有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

筆者通過繪制ROC曲線評(píng)估血清EVs hsa_circ_0005075鑒別診斷RSA患者和正常妊娠者的臨床應(yīng)用價(jià)值,發(fā)現(xiàn)其AUCROC為0.774,當(dāng)cut-off值為2.468時(shí),敏感性和特異性分別為70.3%和75.0%,這表明hsa_circ_0005075可能成為RSA篩查的預(yù)測因子,為RSA的診斷及治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)血清EVs中hsa_circ_0005075的表達(dá)與A-TPO的濃度呈正相關(guān),而甲狀腺功能異常與RSA密切相關(guān),影響胚胎著床發(fā)育,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。本研究結(jié)果也顯示血清EVs中hsa_circ_0005075的表達(dá)與血清ACA(IgA、IgG、IgM)和抗β2GP1(IgA、IgG、IgM)等RSA相關(guān)標(biāo)志物均無關(guān),推測原因可能與本研究納入的患者例數(shù)較少,導(dǎo)致代表性不強(qiáng)有關(guān)。

由于RSA是妊娠常見的并發(fā)癥,所以本研究沒有選取其他妊娠相關(guān)疾病患者。同時(shí),本研究主要是鑒別RSA患者和正常妊娠者,因此沒有選取體檢健康者作為對(duì)照組,后續(xù)會(huì)納入體檢健康者,評(píng)估hsa_circ_0005075在RSA診斷中的價(jià)值。另外,本研究納入的樣本例數(shù)仍偏少,且納入的指標(biāo)也未能涵蓋RSA患者全部的檢測指標(biāo),今后需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,增加指標(biāo)的種類,并且聯(lián)合多中心來探討hsa_circ_000507的臨床應(yīng)用價(jià)值及其在RSA中的作用機(jī)制。