陳貝娥,曹鵬駒,陳發(fā)林(.福州市晉安區(qū)醫(yī)院體檢科,福州 35004;.福建省立醫(yī)院檢驗科,福州 35000)

外泌體是腫瘤微環(huán)境(TME)細胞間通訊的重要信使,可通過細胞間通訊促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。外泌體環(huán)狀RNA(circRNA)具有外泌體功能傳遞和circRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重特性,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用,為腫瘤的診斷、靶向治療、轉(zhuǎn)移預(yù)后等研究提供了新的依據(jù)。Shang等[2]研究發(fā)現(xiàn),外泌體circ_PACRGL可通過靶向miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸,促進結(jié)直腸癌的進展。本課題組在前期研究[3]中對5例肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和5例體檢健康者進行全轉(zhuǎn)錄組二代測序并構(gòu)建了circRNA差異表達譜,選擇LUAD患者中P值差異較小的3個外泌體circRNA(hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896)作為候選circRNA,初步檢測了其在LUAD患者中的表達水平。本研究擬采用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測上述3個circRNA在LUAD患者血清及外泌體中的表達水平,并進一步分析三者在LUAD患者手術(shù)前后血清外泌體中表達水平的差異,評估其臨床篩查效能及其與LUAD患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,旨在尋找有篩查價值的LUAD生物學標志物。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2020年7月至2022年2月在福建省立醫(yī)院胸外科就診的3批次首診為LUAD患者血清樣本240例和體檢健康人群血清樣本94例。分組如下:(1)血清外泌體組:收集LUAD患者血清外泌體樣本127例,其中男50例,女77例,年齡(55.9±12.0)歲,健康人對照組血清外泌體樣本53例,男23例,女30例,年齡(48.1±12.1)歲。(2)血清組:收集LUAD患者血清樣本87例,其中男43例,女44例,年齡(56.3±12.0)歲,健康人對照組血清樣本41例,男20例,女21例,年齡(47.0±12.8)歲。(3)手術(shù)前后血清外泌體組:收集LUAD患者術(shù)前與術(shù)后血清外泌體樣本26例,男8例,女18例,年齡(57.8±12.1)歲。LUAD納入標準:(1)病例組術(shù)后組織活檢確診為LUAD,肺癌分類和診斷標準依據(jù)中華醫(yī)學會腫瘤學分會肺癌臨床診療指南(2021版)分類規(guī)定[4],病理分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟惡性腫瘤TNM分期標準[5];(2)LUAD為原發(fā)灶,既往未進行肺癌的相關(guān)治療。排除標準:(1)患嚴重心腦血管、肝腎功能不全、免疫系統(tǒng)等基礎(chǔ)疾病;(2)不符合納入標準。收集各組研究對象的一般資料(包括年齡、性別、是否吸煙、既往病史、血清CEA水平等)和術(shù)后病理資料(包括病理分型、腫瘤分期等)。本研究經(jīng)福建省立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準文號:K-2021-040-04),各研究對象知情同意。

1.2主要試劑及儀器 exo RNeasy Midi Kit-77144試劑盒、QIAzol Lysis 試劑(德國Qiagen公司),氯仿、分析純無水乙醇(寧波萃英化學技術(shù)公司),PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司),PCR 8聯(lián)管、96孔板(美國Axygen公司),PCR引物(福州尚亞生物科技公司),CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1、ProGRP測定試劑盒(瑞氏Roche公司)。Roche LightCycler480實時熒光定量PCR儀、Cobas e602電化學發(fā)光儀(瑞士Roche公司),Veriti梯度PCR儀(美國ABI公司),5424R臺式高速低溫離心機(德國Eppendorf公司),Nano Drop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 患者均于入院時(體檢健康者于體檢時)采用真空促凝采血管收集清晨空腹狀態(tài)下外周血5 mL, 1 000×g離心10 min,分離血清,分裝至EP管中,置于-80 ℃保存。

1.3.2外泌體、外泌體總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照exo RNeasy Midi Kit-77144試劑盒說明書(分為超高速離心法提取外泌體囊泡以及QIAzol Lysis 試劑提取外泌體總RNA兩步)提取血清外泌體組和健康人對照組、手術(shù)前后血清外泌體組的血清外泌體以及血清外泌體總RNA。用 NanoDrop 2000 超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度,取吸光度 (A260 nm/A280 nm)值為1.8～2.0的樣本,按PrimeScriptTMRT reagent Kit 試劑盒說明書將外泌體總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,樣本濃度稀釋至200 ng/μL,置于-20 ℃保存。

1.3.3引物設(shè)計及qRT-PCR反應(yīng) 根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫(http://www. circbase.org/)提供的引物序列號,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物,并送福州尚亞生物科技有限公司合成。引物序列見表1。按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒及Roche LightCycler480實時熒光定量PCR儀說明書操作對circRNA的表達量進行檢測。以GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)蜻xcircRNA表達量進行校準,circRNA qRT-PCR總反應(yīng)體系為20 μL,包括cDNA模板2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μL,DEPC水6.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。熔解曲線反應(yīng)條件:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。采用LightCycler 480軟件在60 ℃時采集熒光信號并進行熔解曲線分析,以曲線產(chǎn)生單一的目標峰值被認為結(jié)果可靠, 候選 circRNA的相對表達水平以2-ΔΔCt法計算,公式:ΔΔCt=[(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內(nèi)參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個復(fù)孔,重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物大小

1.3.4血清各項腫瘤標志物檢測 采用Roche Cobas e602電化學發(fā)光分析儀與配套的CEA試劑盒檢測各組血清CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1、ProGRP的表達水平。操作步驟嚴格按照儀器及試劑說明書進行。CEA參考區(qū)間為0～5 ng/mL。NSE、SCC、CYFRA21-1、ProGRP參考區(qū)間分別為 0～16.3 ng/mL、0～2.7 ng/mL、0～3.3 ng/mL、0～68.3 pg/L。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR檢測各研究對象血清及外泌體hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的表達 血清外泌體組及血清組檢測結(jié)果顯示,LUAD患者血清外泌體hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的表達水平相對于健康人對照組均顯著上調(diào)。而血清外泌體組與血清組中LUAD患者與健康人對照組3個circRNA的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 LUAD患者與健康人對照組3個circRNA的表達水平

2.2ROC曲線評估3個circRNA對LUAD的篩查效能 與健康人對照相比,血清外泌體組LUAD患者hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的ROC曲線下面積(AUCROC)均高于血清組。見表3、圖1。

注:A,血清外泌體組中3個circRNA對LUAD的篩查效能;B,血清組中3個circRNA 對LUAD的篩查效能。圖1 3個circRNA在血清外泌體組與血清組中對LUAD的篩查效能

表3 3個circRNA在血清外泌體組及血清組中的 ROC曲線分析

2.3血清外泌體組中3個circRNA與LUAD患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在血清外泌體組的127例LUAD患者中,剔除TNM病理分期不明確的12例,最終納入115例進行后續(xù)分析。以hsa_circ_0001439,hsa_circ_0001492,hsa_circ_0000896三者表達水平的中位數(shù)為截斷值分為低表達(n=58)和高表達(n=57)兩組。結(jié)果顯示,血清外泌體hsa_circ_0001439在LUAD患者中的表達水平與T分期、TNM分期相關(guān)(P<0.05);血清外泌體hsa_circ_0001492在LUAD患者中的表達水平與年齡、M分期相關(guān)(P<0.05),并與T分期、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.01);血清外泌體hsa_circ_0000896在LUAD患者中的表達水平與年齡相關(guān)(P<0.05),且與T分期、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.01)。見表4。

表4 3個血清外泌體circRNA表達水平與LUAD患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.43個血清外泌體circRNA與各項腫瘤標志物的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,3個血清外泌體circRNA與CEA、NSE、SCC、ProGRP、CYFRA21-1的表達水平均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表5。

表5 3個血清外泌體circRNA與各項腫瘤標志物的相關(guān)性

2.5qRT-PCR檢測 3個血清外泌體circRNA在手術(shù)前后LUAD患者中的表達 結(jié)果顯示,hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896在LUAD患者術(shù)前的表達水平分別為0.989±1.746、3.084±2.013、3.330±2.088,顯著低于術(shù)后(分別為3.392±1.387、5.023±1.387、6.203±1.567),差異具有統(tǒng)計學意義(t值分別為5.711、4.197、4.966,P<0.001)。

3 討論

circRNA在肺癌的進展過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)外泌體circRNA(hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896)在LUAD患者中的表達水平顯著高于健康人對照組,hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896在LUAD和健康人對照組的AUCROC分別為0.777、0.766、0.793,具有較好的篩查效能。本研究中增加了LUAD患者血清組檢測,發(fā)現(xiàn)血清組與血清外泌體組中hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的表達水平差異無統(tǒng)計學意義。

有研究指出,hsa_circ_0001439受下游hsa-miR-452-5p、hsa-miR-4676-3p的調(diào)控,并且與鋅指蛋白644(zinc finger protein 644,ZNF644)、相應(yīng)癌旁非腫瘤組織中β-環(huán)連蛋白抑制基因1(dishevelled-binding antagonist of beta-catentin 1,DACT1)密切相關(guān);hsa_circ_0001492受下游hsa-miR-106a-3p、hsa-miR-1236-3p的調(diào)節(jié),與卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白43(coiled-coil domain containing 43,CCDC43)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein 5,IGFBP5)基因緊密聯(lián)系[3]。hsa_circ_0000896尚未見報道下游調(diào)控基因。筆者進一步對3個血清外泌體circRNA與LUAD患者臨床病理參數(shù)進行分析,發(fā)現(xiàn)血清外泌體hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和 hsa_circ_0000896在LUAD患者中的表達水平與T分期、TNM分期密切相關(guān),表明3個血清外泌體circRNA對LUAD的臨床分期具有參考價值,是影響LUAD患者生存的重要因素。另外,進一步檢測LUAD患者手術(shù)前后血清外泌體circRNA的表達水平,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和 hsa_circ_0000896在LUAD術(shù)后組表達量顯著下調(diào),表明LUAD實體瘤可能大量表達hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896。

本研究也存在一定的不足之處:(1)本研究納入的臨床樣本數(shù)量和晚期LUAD樣本數(shù)量有限,未考慮將肺部其他疾病納入研究范圍,后期需要繼續(xù)擴大樣本量深入研究,并開展術(shù)后病例追蹤研究,為LUAD的診療、預(yù)后提供參考價值;(2)健康人對照組只進行CEA檢測,相關(guān)的NSE、SCC、ProGRP、CYFRA21-1缺少數(shù)據(jù),因此無法比較分析LUAD和健康人對照組血清NSE、SCC、ProGRP、CYFRA21-1水平。(3)hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896在LUAD中的生物學功能和作用機制仍不清楚,有待于進一步探索研究。