曾君,姜盼盼,張潤玲,王小麗,吳莉萍,紀(jì)國富,呂杰,楊江濤,吳本清(.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)醫(yī)學(xué)實驗中心,廣東深圳 806;.深圳罕見病代謝組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)工程研究中心,廣東深圳 807;.深圳愛灣醫(yī)學(xué)檢驗實驗室,廣東深圳 807;.長春市婦幼保健院計劃生育服務(wù)中心,長春 0000;.葫蘆島市婦幼保健院計劃生育服務(wù)中心,遼寧葫蘆島 000)

臨床上3-羥基異戊酰肉堿(C5-OH)升高可提示多種遺傳代謝病[1],其中,3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥(3-methylcrotonylcoenzyme A carboxylase deficiency, MCCD)是最常見的血液C5-OH升高的遺傳代謝病之一[2]。歐美地區(qū)報道,在新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查中MCCD的發(fā)病率約為1/36 000[3],國內(nèi)報道的發(fā)病率為1/68 333[4]。MCCD的臨床表現(xiàn)變化較大,多數(shù)患者無臨床表征,也有患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)受損,甚至死亡。根據(jù)臨床表現(xiàn)主要分為三類:無癥狀、母源性及有癥狀。有癥狀者可以通過限制亮氨酸或蛋白質(zhì)等誘因飲食,予以高糖保證熱量及各種營養(yǎng)素供應(yīng),如出現(xiàn)嚴(yán)重肉堿缺乏,可以進行L-肉堿補充,而對應(yīng)無癥狀者不需要治療[1]。

MCCD(OMIM 210200/210210)是一種常染色體隱性遺傳病(AR),致病基因主要是位于第3號染色體長臂(3q25-q27)上的MCCC1(methylcrotonyl-CoA carboxylase subunit 1)基因和第5號染色體長臂(5q12-q13)上的MCCC2(methylcrotonyl-CoA carboxylase subunit 2)基因[5]。其發(fā)病機制是由于3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶活性異常致使3-甲基巴豆酰輔酶A堆積,3-甲基巴豆酰輔酶A與甘氨酸結(jié)合生成3-甲基巴豆酰甘氨酸(3-methylcrotonylglycine,3-MCG),使尿液中3-MCG和3-羥基異戊酸(3-hydroxyisovaleric,3-HIVA)濃度升高[1]。本研究旨在探討新生兒篩查C5-OH異常聯(lián)合尿有機酸、基因突變檢測對疾病的鑒別診斷價值。報道如下。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2019年10月至2022年9月在中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)進行遺傳代謝病篩查的14例濾紙干血斑初篩C5-OH濃度高于陽性臨界值(0.45 μmol/L)的新生兒為研究對象,其中男2例,女12例,但僅7例新生兒家長同意進行基因檢測。本研究通過中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:LL-KT-2021163),患兒家屬知情同意。

1.2主要儀器及試劑 衍生化多種有機酸檢測試劑盒(深圳愛灣智造科技有限公司),肌酐檢測試劑盒(深圳普門科技股份有限公司),新生兒遺傳代謝病篩查試劑盒(廣州豐華生物股份有限公司),甲醇、乙酸乙酯(4 L/瓶,色譜純)購自上海安譜公司、MultipSeq?Custom Panel文庫構(gòu)建試劑盒[艾吉泰康(嘉興)生物科技有限公司]。GCMS QP 2020 NX型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司),H1650R臺式高速離心機、尿微量蛋白肌酐生化儀、恒溫培養(yǎng)箱(東莞譜標(biāo)科技公司),氮氣吹掃儀 (杭州瑞誠儀器公司),Qubit?3.0熒光定量儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),Aglient 2100生物分析儀(美國Agilent公司), MGI 2000高通量測序平臺(深圳華大智造科技股份有限公司),串聯(lián)質(zhì)譜儀(API 3200MD,美國AB SCIEX公司)。

1.3方法

1.3.1樣本收集 使用枸櫞酸鈉真空抗凝管采集新生兒非空腹靜脈血1.0 mL, 4 ℃保存?zhèn)溆?。干燥潔凈容器采集新生兒新鮮隨機尿液,分裝至容量為10 mL的帶蓋無菌刻度離心管中,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)檢測C5-OH濃度 按照串聯(lián)質(zhì)譜儀(API 3200MD)及新生兒遺傳代謝病篩查試劑盒說明書操作檢測樣本中氨基酸和?；鈮A含量。其中,C4DC+C5-OH參考區(qū)間:0.06～0.45 μmol/L,(C4DC+C5-OH)/C0參考區(qū)間:0.01～0.03,(C4DC+C5-OH)/C8參考區(qū)間:0.50～12.85。

1.3.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)檢測尿液有機酸水平 按照衍生化多種有機酸檢測試劑盒說明書將待測尿液經(jīng)除尿素、添加內(nèi)標(biāo)、肟化、液液萃取、氮吹、衍生等處理后,使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定132種尿液有機酸水平,通過測定有機酸目標(biāo)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物十七烷酸峰面積求得比值×100,得到半定量結(jié)果[6]。其中,針對3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥可參考3-羥基異戊酸-2(參考區(qū)間:0.00～6.10)、3-甲基巴豆酰甘氨酸-1(參考區(qū)間:0.00～1.05)、3-甲基巴豆酰甘氨酸-2(參考區(qū)間:0.00～0.52)含量;生物素酶缺乏癥和全羧化酶合成酶缺乏癥可參考3-羥基丙酸-2(參考區(qū)間:0.00～1.95)、甲基枸櫞酸-4(參考區(qū)間:0.00～1.81)、3-甲基巴豆酰甘氨酸-1、3-甲基巴豆酰甘氨酸-2含量;3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥可參考3-羥基-3-甲基戊二酸-3(參考區(qū)間:0.00～30.52);3-甲基戊烯二酸尿癥可參考3-甲基戊烯二酸-2(參考區(qū)間:0.00～0.50)、3-甲基戊二酸-2(參考區(qū)間:0.00～10.48)含量;β-酮硫解酶缺乏癥可參考2-甲基-3-羥基丁酸-2(參考區(qū)間:0.00～7.65)含量。

1.3.4高通量測序技術(shù)檢測基因突變 提取血液樣本DNA,按照MultipSeq?Custom Panel文庫構(gòu)建試劑盒進行第一輪多重PCR擴增(T1和T2運行 95 ℃ 3 min 30 s;98 ℃ 20 s,60 ℃ 10 min,22個循環(huán)s;72 ℃ 5 min),純化產(chǎn)物后[純化磁珠(IGTTMPure Beads)+磁力架]再次進行PCR連接測序接頭(95 ℃ 3 min 30 s;98 ℃ 20 s,58 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,9個循環(huán);72 ℃ 5 min),純化獲得目標(biāo)區(qū)域序列文庫[純化磁珠(IGTTMPure Beads)+磁力架],使用Qubit?3.0熒光定量儀與Aglient 2100生物分析儀進行文庫質(zhì)控;質(zhì)控通過后利用MGI 2000高通量測序平臺完成測序數(shù)據(jù)收集,獲得平均測序深度≥100×,測序深度大于20×且達到95%以上的為有效數(shù)據(jù)。

1.3.5生物信息學(xué)尋找突變位點 數(shù)據(jù)通過BWA(Burrows-Wheeler Aligner)[7]軟件比對到人參考基因組(Human_B37),使用GATK(Genome Analysis ToolKit)[8]分析變異信息、ANNOVAR軟件進行變異注釋[9],包括dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組計劃和其他已有的數(shù)據(jù)庫的注釋信息,注釋內(nèi)容涵蓋人群頻率、變異類型、功能預(yù)測(SIFT、Polyphen2、Mutation Taster等)、HGMD/Clinvar等致病性分類信息。變異致病性解讀基于《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南(2017)》[10],共分為“致病”、“可能致病”、“意義未明”、“可能良性”及“良性”五類。

2 結(jié)果

2.1血液C5-OH和尿有機酸檢測結(jié)果 14 例新生兒血液 C5-OH復(fù)檢濃度均高于陽性臨界值(0.45 μmol/L),濾紙干血斑初篩C5-OH的濃度區(qū)間為0.60～9.24 μmol/L,復(fù)檢血液C5-OH的濃度區(qū)間為0.57～11.61 μmol/L。超過50%(8/14)的復(fù)檢病例血液C5-OH濃度出現(xiàn)回落。除病例11與病例4之外,其余樣本尿液有機酸檢測3-甲基巴豆酰甘氨酸(3-MCG)與3-羥基異戊酸(3-HIVA)濃度正常;病例11初檢和復(fù)檢C5-OH濃度均超出陽性臨界值20倍以上,尿液有機酸中3-羥基異戊酸(171.45 μmol/L),3-甲基巴豆酰甘氨酸(43.08 μmol/L)升高,結(jié)合血液中氨基酸及?；鈮A的分析結(jié)果,提示3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥。見表1。

表1 血液酰基肉堿和尿液有機酸檢測結(jié)果

2.2基因突變檢測結(jié)果 參與基因突變檢測的7例新生兒在6個基因上共檢測出2種突變類型和12個突變位點(表2)。其中在MCCC1與MCCC2基因檢測出6個突變位點,均為雜合突變,分別為c.1518delG,c.-102C>T,c.1331G>A,c.1732-1G>C,c.470A>G,c.1103G>A,其中c.1518delG突變等級為致病,c.1331G>A和c.1732-1G>C為疑似致病,其余位點為意義未明,MCCC1基因位點(3:182817330*,NM_020166.3,c.-102C>T)為新發(fā)突變,可以補充突變與疾病的關(guān)系。

表2 基因突變檢測結(jié)果及臨床隨訪結(jié)果

病例4濾紙干血斑C5-OH初篩、血液復(fù)檢結(jié)果持續(xù)升高(0.85 μmol/L、1.02 μmol/L),MCCC1基因存在致病突變(c.1518delG),確診為MCCD。后續(xù)隨訪顯示患兒生長發(fā)育正常(3歲1月),屬于無癥狀MCCD患者,并且患兒攜帶β-地中海貧血CD41-42雜合突變。病例11攜帶2個MCCC2基因雜合突變(c.470A>G,c.1103G>A),突變等級為意義未明,最近一次患兒2歲6月時的隨訪顯示生長發(fā)育正常,結(jié)合隨訪、血尿檢測及基因結(jié)果診斷為無癥狀MCCD。病例5在半乳糖神經(jīng)酰胺酶(galactocerebrosidase,GALC)基因上檢測到c.1901T>C雜合突變,突變等級為致病變異,該基因為克拉伯病的致病基因,研究人員隨訪過程中未見異常。病例6 和8分別在MCCC1基因上檢測到c.1331G>A和c.1732-1G>C雜合突變,突變等級為疑似致病,尿有機酸3-MCG和3-HIVA結(jié)果正常,隨訪未見患兒生長發(fā)育異常。病例7在半乳糖激酶1(galactokinase 1,GALK1)基因上發(fā)現(xiàn)2個意義未明的雜合突變;病例9在羥烷基輔酶A脫氫酶(hydroxyacyl-coA dehydrogenase,HADH)基因上發(fā)現(xiàn)c.112A>T 雜合突變,突變等級為意義未明,該基因突變可引起3-羥?；o酶A脫氫酶缺乏癥或家族性高胰島素性低血糖血癥4型,隨訪過程中生長發(fā)育未見異常。

2.3C5-OH升高在多種疾病中的鑒別診斷流程 本研究中病例11孕期無特殊異常,足月剖宮產(chǎn)出生體重4.05 kg,身長50 cm,阿普加(Apgar)1 min和5 min評分均為10分,隨訪出生12 d、2月、3月生長發(fā)育檢查無異常,最近一次在患兒年齡2歲6月時的隨訪中生長發(fā)育未見異常,患兒在初篩時C5-OH(9.24 μmol/L),復(fù)檢升至C5-OH(11.61 μmol/L),臨床提示MCCD、3-甲基戊烯二酰輔酶A水解酶缺乏癥、3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A裂解酶缺乏癥、生物素酶缺乏癥、全羧化酶合成酶缺乏癥及β-酮硫解酶缺乏癥等6種疾病可能,后續(xù)利用GC-MS檢測尿有機酸結(jié)果提示3-羥基異戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸升高,結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)診斷為無癥狀MCCD患者。同時,在患兒MCCC2基因上發(fā)現(xiàn)2個意義未明的雜合突變,輔助臨床進一步診斷。在參考美國相關(guān)流程圖(American College of Medical Genetics, 2009)[11]的基礎(chǔ)上,結(jié)合臨床病例報道及國內(nèi)專家共識和相關(guān)指南的建議[6,12-24],繪制了C5-OH升高可能的鑒別診斷流程,見圖1。

注:C5-OH,3-羥基異戊酰肉堿;C5:1,異戊烯酰肉堿;C3,丙酰肉堿;3-MCG,3-甲基巴豆酰甘氨酸;HMG,3-羥基3-甲基戊二酸;HMG-CoA,3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A;2M3HBA,2-甲基-3-羥基丁酸;3-MGA,3-甲基戊烯二酸。圖1 C5-OH升高在多種疾病中的鑒別診斷流程

3 討論

MCCD和多種羧化酶缺乏癥是最常見的血液C5-OH增高的遺傳代謝病,MCCD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是基因突變檢測[22],本研究中病例4孕期無特殊異常,足月順產(chǎn)出生體重2.55 kg,身長48 cm,阿普加(Apgar)1 min和5 min評分均為10分,最近一次在年齡3歲1月隨訪中生長發(fā)育未見異常;患兒初篩C5-OH為0.85 μmol/L,復(fù)檢結(jié)果為1.02 μmol/L,提示可能為生物素缺乏、多種羧化酶缺乏癥或MCCD,并建議尿液有機酸分析和基因檢測,同時建議母親進行串聯(lián)質(zhì)譜檢測以排除母源性因素,但遺憾的是父母未能配合進行患兒尿液有機酸檢測,患兒后期隨訪中進行基因突變檢測,在MCCC1基因上發(fā)現(xiàn)2個雜合突變,其中1個突變等級為致病突變,另1個為意義未明,均提示MCCD。孟衛(wèi)京等[22]在2019年報道1例MCCC基因上發(fā)現(xiàn)c.470A>G意義未明突變,但患兒尿中3-MCG輕度增高,臨床無任何癥狀,6個月時檢驗各項指標(biāo)均恢復(fù)正常;在另一篇關(guān)于MCCD的報道指出,所有患兒臨床無癥狀,生長及智能發(fā)育正常,在21例疑似MCCD中僅11例檢出MCCC1突變[23]。C5-OH異常增高在臨床上還有一種原因是母源造成的一過性異常,2013年,宮麗霏等[24]在國內(nèi)首報了5例母源性MCCD,在隨訪時均無臨床癥狀,生長及智能發(fā)育正常。

MCCD患兒臨床表型各異,大多數(shù)患兒為無癥狀的MCCD,少數(shù)可表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受損[25],本研究中病例4和病例11患兒篩查時血液C5-OH濃度明顯增高,召回后血濃度繼續(xù)升高,且病例11伴尿3-MCG和3-HIVA含量顯著增高,結(jié)合隨訪資料臨床診斷為無癥狀MCCD患者;文獻報道無癥狀MCCD患兒一般無需治療,隨訪數(shù)年至10年仍無癥狀[26-27],但從臨床的角度分析,本研究中的2例無癥狀MCCD患兒在后期隨訪過程中需密切關(guān)注患兒整體生長發(fā)育情況,預(yù)防患兒后期出現(xiàn)代謝異常而誤診為其他疾病,錯過提前干預(yù)治療的時間。

綜上所述,本研究顯示通過MS/MS、GC-MS、基因突變檢測技術(shù)可實現(xiàn)C5-OH濃度異常增高的鑒別診斷,但本研究納入的臨床病例較少,研究結(jié)果僅能體現(xiàn)研究對象的個體情況,存在一定的局限性,對無癥狀MCCD患兒需要長期隨訪累積更多資料進行綜合評估。