朱 靖，姜一弘，吳 侃，鄭澤宇，張 鵬，暢 通，張卓儒，王 菲，王昊天，張 敏，王小成

(空軍軍醫(yī)大學(xué)：1航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天臨床醫(yī)學(xué)中心，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2西京醫(yī)院空勤科，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員三大隊(duì)，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員四大隊(duì)，陜西 西安 710032)

隨著航空兵部隊(duì)高性能戰(zhàn)機(jī)的全面列裝，戰(zhàn)機(jī)發(fā)動(dòng)機(jī)功率增加、座艙內(nèi)各類電子設(shè)備換代，這導(dǎo)致了飛機(jī)內(nèi)外噪聲強(qiáng)度、功率、頻譜發(fā)生明顯變化，由此引發(fā)的飛行人員聽力障礙問題也更加突出[1-2]。持續(xù)暴露于高強(qiáng)度噪聲，飛行人員會(huì)發(fā)生永久性聽閾下降，導(dǎo)致噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss，NIHL)[1]。為解決這一問題，航空兵部隊(duì)普遍采用聽力保護(hù)裝置如耳塞、聲音衰減耳罩等措施進(jìn)行防護(hù)，但上述措施僅能夠降低20～45 dB噪聲，部隊(duì)官兵仍長期處于中等強(qiáng)度的噪聲環(huán)境。長期中強(qiáng)度噪聲暴露，雖不會(huì)引起聽閾下降，但會(huì)出現(xiàn)噪聲環(huán)境下言語識別障礙、耳鳴和聽覺敏感等癥狀，臨床上稱作隱匿性聽力損失(hidden hearing loss，HHL)[3]。研究表明，臨床聽覺障礙的患者群體中，約19%聽閾正常，僅表現(xiàn)為噪聲環(huán)境言語識別障礙[4]。在飛行時(shí)間5年以上的飛行人員群體中，超過47.5%人群體驗(yàn)過噪聲環(huán)境下無線電用語識別障礙[5]。因此，噪聲引起的HHL是威脅飛行安全、降低飛行人員作戰(zhàn)效能的重要航空醫(yī)學(xué)問題，探索HHL言語認(rèn)知障礙的原因?qū)τ谧龊迷肼暦雷o(hù)和提升戰(zhàn)斗力具有重要意義。

前期在以小鼠為模型的HHL研究中，探索了噪聲暴露后引起的耳蝸帶狀突觸損傷、毛細(xì)胞功能障礙、耳蝸傳入神經(jīng)纖維損傷以及聽神經(jīng)纖維暫時(shí)性脫髓鞘等變化，這些研究主要集中在外周聽覺感受器的病理變化[6-7]，但HHL患者出現(xiàn)的噪聲環(huán)境下言語識別障礙、耳鳴和聽覺敏感等臨床癥狀的直接原因尚不明確。事實(shí)上，言語認(rèn)知主要依賴于聽覺中樞對聲信號的準(zhǔn)確編碼，耳蝸核是聽覺中樞初級核團(tuán)，耳蝸核內(nèi)的信息處理是中樞聽覺處理的第一環(huán)節(jié)，主要接收螺旋神經(jīng)節(jié)的傳入信號，負(fù)責(zé)收集由內(nèi)耳毛細(xì)胞傳導(dǎo)的聽覺信息，同時(shí)收集整合傳入的體感信號以及前庭信號，在聽覺信息的編碼傳導(dǎo)以及聽覺定位中有著重要的作用[8]。本研究中，我們成功構(gòu)建了小鼠HHL模型，通過聽覺暫時(shí)性閾移、閾上刺激ABR Ⅰ波幅值降低水平來評估小鼠聽力水平，并利用c-Fos蛋白免疫熒光染色方法分析軍事航空噪聲暴露對小鼠耳蝸核神經(jīng)元激活狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡雄性C57BL/6J小鼠，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量約15～17 g，無噪聲暴露史，聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測試篩選聽閾正常的小鼠用于實(shí)驗(yàn)研究。所有小鼠于潔凈動(dòng)物房進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，提供充足飲食飲水，控制溫度22～24 ℃，12 h/12 h明暗循環(huán)光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號：20230375)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 戊巴比妥鈉(Sigma，美國)；速眠新Ⅱ注射液(華牧動(dòng)物保健品有限公司，中國)；TritonX-100(MP Biomedicals，美國)；PBS(Biosharp，中國)；即用型山羊血清(BOSTER，中國)；Anti-Fos B抗體(1∶500，Abcam，英國)；山羊抗鼠二抗(1∶250，Proteintech，美國)；BSA(BioFroxx，德國)；含DAPI抗熒光淬滅封片液(Beyotime，中國)；注射泵(廣州匯特醫(yī)療科技有限公司)；OCT(Sakura，美國)；冰凍切片機(jī)(Leica，德國)；共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)；音箱(廣州聲霸智能科技有限公司)；功放(廣州聲霸智能科技有限公司)；聲級計(jì)(廣州宏誠集業(yè)電子科技有限公司)；腦干誘發(fā)電位儀(Otometrics ICS chapter EP，丹麥)；共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)前對所有C57小鼠進(jìn)行ABR測量，將聽力正常的小鼠隨機(jī)分為3組，按照課題組前期造模條件給予噪聲暴露，其中HHL組小鼠給予110 dB SPL 2 h噪聲暴露，NIHL組小鼠給予115 dB SPL 4 h噪聲暴露，未給予噪聲暴露的作為對照組(CON組)。按照噪聲暴露后時(shí)間再進(jìn)行分組，分別為噪聲暴露后1 d、噪聲暴露后7 d、噪聲暴露后14 d、噪聲暴露后28 d，每組6只。

1.2.2 噪聲暴露 實(shí)驗(yàn)噪聲為我國某航空兵部隊(duì)軍用直升機(jī)采集聲音，經(jīng)存儲(chǔ)介質(zhì)導(dǎo)入功放后循環(huán)播放。將小鼠置于鼠籠后，放于揚(yáng)聲器正下方。給予噪聲刺激前，用聲級計(jì)測試噪聲強(qiáng)度，確保小鼠活動(dòng)范圍內(nèi)聲壓級相差<3 dB。實(shí)驗(yàn)組小鼠按照分組接受相應(yīng)強(qiáng)度和時(shí)間的噪聲刺激，對照組不給予噪聲刺激，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.2.3 ABR測試 按照時(shí)間節(jié)點(diǎn)，在噪聲暴露前后進(jìn)行ABR測量，采用10 g/L戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)聯(lián)合10 mL/L速眠新Ⅱ(0.04 mL)腹腔注射小鼠進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，將記錄電極插于小鼠顱頂正中雙耳連線中點(diǎn)皮下，兩個(gè)參考電極分別插于雙耳耳后皮下，接地電極插于尾部正中。實(shí)驗(yàn)采用短聲(click)作為刺激聲，刺激強(qiáng)度從80 dB開始，以10 dB SPL為間隔遞減，以能分辨出Ⅲ波的最低刺激聲強(qiáng)度為聽力閾值，同時(shí)記錄click 80 dB SPL刺激下Ⅰ波波幅和Ⅰ波潛伏期。測量方法使用儀器配套軟件工具，以波型基線到Ⅰ波峰值頂點(diǎn)測量值作為Ⅰ波波幅，以Ⅰ波峰值出現(xiàn)時(shí)間作為Ⅰ波潛伏期。

1.2.4 耳蝸核冰凍切片 采用10 g/L戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)聯(lián)合10 mL/L速眠新Ⅱ(0.04 mL)腹腔注射小鼠進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，在小鼠劍突下剪一“V”字形開口，使小鼠心臟完全暴露后，灌注的尖針插入動(dòng)物的左心室，使用注射泵將約20 mL的0.01 mol/L PBS(pH=7.4)沖去體內(nèi)血液，而后用40 g/L多聚甲醛溶液40 mL進(jìn)行灌注固定。去除顱骨后將小鼠全腦完整取出，放入40 g/L多聚甲醛固定液中4 ℃固定24 h，而后將腦組織浸泡300 g/L蔗糖溶液中4 ℃至組織沉底。腦組織用OCT包埋后，恒冷箱切片機(jī)冠狀切片，切片厚度為35 μm，分別收入0.01 mol/L PBS中，漂洗3次后進(jìn)行后續(xù)的免疫熒光染色。

1.2.5 免疫熒光染色 取出切好的冰凍切片，加入適量自配封閉液(9.5 mL 0.01 mol/L PBS，30 μL Triton X-100，500 μL即用型山羊血清)室溫封閉1 h，而后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。向樣本加入Anti-Fos B抗體(ab11959，Abcam，英國)，并于4 ℃冰箱孵育72 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。向每個(gè)樣本內(nèi)加入適量山羊抗鼠二抗(488，SA00013-1，Proteintech，美國)，避光4 ℃冰箱孵育24 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。將樣本移至載玻片上鋪平，滴上適量含DAPI的抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片。將封好的玻片置于黑盒內(nèi)，于-20 ℃冰箱內(nèi)暫存。

1.2.6 共聚焦和c-Fos蛋白陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù) 使用共聚焦顯微鏡對耳蝸核進(jìn)行觀察，選用放大倍數(shù)為10倍的鏡頭，激發(fā)光波長分別為488 nm和340 nm，對耳蝸核區(qū)域進(jìn)行觀察并拍照，用ImageJ軟件對視野內(nèi)c-Fos蛋白陽性的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ABR測試結(jié)果比較

2.1.1 ABR閾值 各組噪聲暴露前后ABR click處聽閾變化結(jié)果如圖1所示，HHL組在110 dB SPL 2 h軍事航空噪聲暴露后1、7 d測得聽閾明顯升高(P<0.01)，隨著時(shí)間推移聽閾逐漸恢復(fù)，14、28 d與對照組聽閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NIHL組在115 dB SPL 4 h軍事航空噪聲暴露后1 d測得聽閾明顯升高(P<0.01)，雖然隨著時(shí)間推移在7、14、28 d測得聽閾有所恢復(fù)，但仍然明顯高于對照組聽閾(P<0.01)。

CON組：對照組；HHL組：隱匿性聽力損失組；NIHL組：噪聲性聽力損失組。n=12。bP<0.01。

2.1.2 ABR Ⅰ波波幅 各組噪聲暴露前后ABR click 80 dB SPL處Ⅰ波波幅結(jié)果如圖2所示，HHL組和NIHL組在噪聲暴露后Ⅰ波波幅明顯下降(P<0.01)。HHL組Ⅰ波波幅隨著時(shí)間推移有較明顯恢復(fù)，但在噪聲暴露后28 d仍然低于對照組(P<0.01)；NIHL組Ⅰ波波幅隨著時(shí)間推移無明顯恢復(fù)，在各時(shí)間段都明顯低于對照組(P<0.01)。

CON組：對照組；HHL組：隱匿性聽力損失組；NIHL組：噪聲性聽力損失組。n=12。aP<0.05，bP<0.01。

2.1.3 ABR Ⅰ波潛伏期 各組噪聲暴露前后ABR click 80 dB SPL處Ⅰ波潛伏期結(jié)果如圖3所示，HHL組在噪聲暴露后各時(shí)間段潛伏期變化幅度較小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NIHL組在噪聲暴露后1、7 d潛伏期明顯延長(P<0.01)，14、28 d時(shí)潛伏期基本恢復(fù)，與CON組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CON組：對照組；HHL組：隱匿性聽力損失組；NIHL組：噪聲性聽力損失組。n=12。bP<0.01。

2.2 噪聲暴露后耳蝸核神經(jīng)元c-Fos蛋白表達(dá)的改變

為了探究噪聲暴露對于小鼠耳蝸核神經(jīng)元激活水平的影響，我們分別觀察了在有無聲音刺激條件下，耳蝸核神經(jīng)元c-Fos表達(dá)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后，在無聲音刺激情況下(圖4)，與對照組相比，HHL組耳蝸核c-Fos陽性神經(jīng)元顯著增多(P<0.01)，隨時(shí)間推移數(shù)量下降，但在噪聲暴露后28 d c-Fos蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)元數(shù)量仍然高于對照組(P<0.05)；NIHL組耳蝸核c-Fos蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)元僅在噪聲暴露后1 d增多(P<0.01)，隨時(shí)間推移數(shù)量下降，噪聲暴露后7 d和14 d明顯低于對照組(P<0.05)，28 d時(shí)的數(shù)量和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對比HHL組與NIHL組耳蝸核c-Fos蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)元數(shù)量，噪聲暴露后各時(shí)間段NIHL組明顯低于HHL組(P<0.01)。

A：噪聲暴露后不同時(shí)間無聲音刺激各組耳蝸核c-Fos陽性神經(jīng)元免疫熒光染色圖；B～E：噪聲暴露后1 d(B)、7 d(C)、14 d(D)、28 d(E)無聲音刺激各組耳蝸核c-Fos陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。CON組：對照組；HHL組：隱匿性聽力損失組；NIHL組：噪聲性聽力損失組。標(biāo)尺為100 μm。n=6。aP<0.05，bP<0.01。

噪聲暴露后，取材前給予80 dB SPL 2 h聲音刺激情況下(圖5)，相較于對照組，在噪聲暴露后1 d，HHL組耳蝸核c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量增加(P<0.01)，噪聲暴露后7 d持續(xù)增多(P<0.01)，噪聲暴露后14 d和28 d與對照組差異減小，但仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NIHL組耳蝸核c-Fos蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)元在噪聲暴露后1 d和7 d高于對照組(P<0.01)，14 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，噪聲暴露后28 d數(shù)量小于對照組(P<0.05)；噪聲暴露后1 d，HHL組和NIHL組耳蝸核c-Fos蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)元數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，7 d和14 d NIHL組數(shù)量明顯低于HHL組(P<0.01)，28 d差異更加顯著(P<0.01)。

A：噪聲暴露后不同時(shí)間有聲音刺激各組耳蝸核c-Fos陽性神經(jīng)元免疫熒光染色圖；B～E：噪聲暴露后1 d(B)、7 d(C)、14 d(D)、28 d(E)有聲音刺激各組耳蝸核c-Fos陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。CON+STIM組：對照組(80 dB SPL 2 h聲音刺激)；HHL+STIM組：隱匿性聽力損失組(80 dB SPL 2 h聲音刺激)；NIHL+STIM組：噪聲性聽力損失組(80 dB SPL 2 h聲音刺激)。標(biāo)尺為100 μm。n=6。aP<0.05，bP<0.01。

3 討論

HHL以中等強(qiáng)度噪聲刺激后，純音聽閾正常，而噪聲環(huán)境下言語識別障礙為典型臨床表現(xiàn)。在軍事飛行活動(dòng)中，飛行人員經(jīng)常處在高于80 dB的噪聲環(huán)境中[9]，一旦無法有效識別飛行指令，將對飛行作戰(zhàn)任務(wù)產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響[10]。但噪聲環(huán)境下言語識別障礙的發(fā)生機(jī)制尚不明確，以往研究認(rèn)為，耳蝸毛細(xì)胞低自發(fā)放電率、高閾值的帶狀突觸是完成背景噪聲條件下聲信號識別及編碼等功能的重要結(jié)構(gòu)[11-12]，而中等強(qiáng)度噪聲刺激將首先造成這類帶狀突觸丟失[13]。但是聽覺形成過程中存在著復(fù)雜的傳遞、編碼和調(diào)節(jié)過程，由聲信號感覺到言語認(rèn)知的形成過程主要依賴于各級聽覺中樞及高級認(rèn)知腦區(qū)對聲信號的準(zhǔn)確編碼和調(diào)控來完成。因此，從聽覺中樞可塑性變化角度切入是探索噪聲環(huán)境言語識別障礙發(fā)生機(jī)制的重要方向。本研究初步觀察了HHL小鼠耳蝸核神經(jīng)元存在過度激活，可能導(dǎo)致了噪聲條件下言語識別障礙。

本研究中，我們首先以聽覺暫時(shí)性閾移、ABRⅠ波幅值降低作為指標(biāo)，并依據(jù)本課題組前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[14]，分別將C57小鼠暴露于110 dB SPL軍事航空噪聲中2 h和115 dB SPL軍事航空噪聲中4 h，分別建立HHL小鼠模型和NIHL小鼠模型。在噪聲暴露后，HHL組及NIHL組小鼠ABR的Ⅰ波波幅都有明顯下降，而ABR的Ⅰ波波幅與耳蝸帶狀突觸數(shù)量和功能密切相關(guān)[15-16]，說明噪聲刺激導(dǎo)致了帶狀突觸損傷。而Ⅰ波潛伏期僅在NIHL組噪聲暴露后1 d和7 d延長，隨時(shí)間推移又恢復(fù)，這與以往研究結(jié)論相同[17]。通過比較各組噪聲暴露前后ABR閾值發(fā)現(xiàn)，110 dB SPL 2 h噪聲暴露后，小鼠聽閾出現(xiàn)暫時(shí)性閾移；115 dB SPL 4 h噪聲暴露后，小鼠聽閾出現(xiàn)永久性閾移，因此兩種噪聲暴露條件分別達(dá)到建立軍事航空噪聲性HHL和NIHL小鼠模型條件。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度的噪聲暴露會(huì)損傷特定頻率的聽神經(jīng)纖維亞群的完整性，導(dǎo)致聽覺中樞下丘核團(tuán)發(fā)生適應(yīng)性編碼改變[18]，而下丘核團(tuán)的聽覺信息輸入主要來源于耳蝸核的上行投射。另有研究表明，強(qiáng)噪聲暴露后耳蝸核的突觸發(fā)生了重組反應(yīng)[19]。因此，我們首先關(guān)注了不同強(qiáng)度噪聲刺激后耳蝸核神經(jīng)元激活情況，通過在取材前給予安靜條件或80 dB SPL 2 h背景聲音刺激處理，分別評估各組小鼠耳蝸核在有無聲信號輸入條件下的神經(jīng)元激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取材前不給予背景聲音刺激，HHL組小鼠耳蝸核神經(jīng)元在噪聲暴露后的不同時(shí)間點(diǎn)始終存在過度激活，這種過度激活的狀態(tài)并未隨著聽閾恢復(fù)而降至正常水平(圖4)，與之伴隨的是以ABR Ⅰ波波幅明顯下降為特征的帶狀突觸損傷持續(xù)存在(圖2)。我們認(rèn)為這是由于帶狀突觸損傷導(dǎo)致的聲信號傳入減弱和信號傳遞方式發(fā)生改變，耳蝸核神經(jīng)元通過增強(qiáng)自發(fā)性電活動(dòng)以實(shí)現(xiàn)功能性代償，以往研究表明，這種代償性的興奮性增高會(huì)降低各級聽覺中樞對聲信號編碼的準(zhǔn)確性[20-21]。與之相對的則是NIHL組小鼠耳蝸核神經(jīng)元激活水平先升高，后逐漸降低(圖4)，這可能是由于NIHL組在噪聲暴露后的早期代償較為充分，耳蝸核神經(jīng)元保持較高的興奮性，隨著大量毛細(xì)胞永久性丟失[22]，導(dǎo)致外周信號輸入大幅度降低，長期缺乏來自外周的信號輸入刺激，這種代償反應(yīng)逐漸減弱，直至神經(jīng)元興奮性低于對照組和HHL組。而這一現(xiàn)象在取材前給予背景聲音刺激的實(shí)驗(yàn)研究中也得到了印證，在給予80 dB SPL 2 h聲音刺激后，對照組小鼠耳蝸核神經(jīng)元激活數(shù)量增多，而HHL組小鼠耳蝸核神經(jīng)元依然在噪聲暴露后持續(xù)存在過度激活(圖5)。NIHL組小鼠則由于聽閾升高，在噪聲暴露后初期通過代償來彌補(bǔ)，而隨著代償反應(yīng)的消失，即使給予閾上刺激，傳入的聲音信號不足以激活耳蝸核編碼正常的聽覺信息，因此神經(jīng)元激活數(shù)量減少，明顯低于對照組和HHL組(圖5)。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有聲音刺激時(shí)，耳蝸核神經(jīng)元過度激活在噪聲暴露后第7日達(dá)到峰值(圖5)，而無聲音刺激時(shí)，這種過度激活的峰值是在暴露后第1日(圖4)，我們分析這可能是由于耳蝸核神經(jīng)元同時(shí)接受來自上級聽覺中樞的下行調(diào)控，而上級聽覺中樞發(fā)生顯著代償性可塑性變化的時(shí)間較之耳蝸核延后，因此，出現(xiàn)了給予聲音刺激后耳蝸核神經(jīng)元激活數(shù)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間較之于安靜條件時(shí)有所延遲。

本研究存在一定局限性：①耳蝸核存在不同類型的神經(jīng)元，分別發(fā)揮著不同編碼功能，而過度激活的神經(jīng)元屬于哪種類型依然需要進(jìn)行免疫熒光共染、神經(jīng)元形態(tài)學(xué)分析等研究；②耳蝸核神經(jīng)元接受外周聽覺信息傳入，同時(shí)也受到上級聽覺中樞發(fā)出下行投射神經(jīng)元的調(diào)控，而下行調(diào)控神經(jīng)元異常是否在耳蝸核神經(jīng)元過度激活發(fā)揮更重要的作用依然不清楚，后續(xù)需通過調(diào)控投射神經(jīng)元等方法進(jìn)行深入的機(jī)制研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，110 dB SPL 2 h軍事航空噪聲暴露引起小鼠HHL表現(xiàn)為聽覺暫時(shí)性閾移、ABR Ⅰ波幅值降低，HHL組小鼠耳蝸核神經(jīng)元出現(xiàn)了過度激活，可能引起噪聲暴露后的聲信號編碼異常，導(dǎo)致噪聲環(huán)境下言語識別障礙。探明噪聲暴露后各級聽覺中樞神經(jīng)可塑性變化的規(guī)律及機(jī)制，對未來探索噪聲的有效防治措施具有重要意義。