姜一弘，張 敏，朱 靖，王 菲，鄭澤宇，劉玉輝，李聰聰，張卓儒，暢 通，王小成

(空軍軍醫(yī)大學(xué)：1航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天臨床醫(yī)學(xué)中心，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2西京醫(yī)院空勤科，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員三大隊(duì)，陜西 西安 710032；4空軍杭州特勤療養(yǎng)中心療養(yǎng)五區(qū)，江蘇 無錫 214125)

隱匿性聽力損失(hidden hearing loss，HHL)是近年來受到人們廣泛關(guān)注的一種新型聽力損失類型?；颊咧髟V聆聽困難，特別是噪聲環(huán)境下言語識別困難，但聽閾檢測基本正常[1]。前期研究初步認(rèn)為，HHL是一種可恢復(fù)的暫時性毛細(xì)胞損傷，其主要病理基礎(chǔ)可能是耳蝸帶狀突觸受損和毛細(xì)胞功能異常，但到目前為止，HHL的確切發(fā)病機(jī)制和病理基礎(chǔ)尚不完全清楚，需要進(jìn)行深入研究[2]。

軍事航空噪聲主要由軍用飛機(jī)的自旋翼、渦輪發(fā)動機(jī)、傳動系統(tǒng)等產(chǎn)生，軍事航空噪聲強(qiáng)度高，容易導(dǎo)致部隊(duì)官兵聽覺系統(tǒng)受損。由于長期暴露于高性能戰(zhàn)機(jī)產(chǎn)生的高強(qiáng)度噪聲環(huán)境中，航空兵部隊(duì)空勤和地勤人員極易罹患軍事航空噪聲性聽力損失[3]。

高強(qiáng)度噪聲導(dǎo)致聽閾顯著升高，發(fā)生永久性閾移即噪聲性耳聾。研究證實(shí)中等強(qiáng)度噪聲暴露會導(dǎo)致HHL[4-5]。近年來，HHL的機(jī)制和防治研究成為了國內(nèi)外聽覺領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但目前仍無成熟的軍事航空噪聲性HHL C57小鼠動物模型[6-10]。本研究擬通過比較不同強(qiáng)度和不同時間軍用直升機(jī)噪聲暴露前后聽功能和內(nèi)耳形態(tài)上的差異，建立軍事航空噪聲性HHL C57小鼠動物模型，為進(jìn)一步探究其致病機(jī)制和防護(hù)措施提供參考模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)所用動物為4周齡雄性C57BL/6J小鼠，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)前無噪聲暴露史。小鼠飼養(yǎng)于普通潔凈動物房，自然光照，室溫21～25 ℃。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有實(shí)驗(yàn)操作均得到空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：20220331)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 戊巴比妥鈉(Sigma，美國)；速眠新Ⅱ注射液(華牧動物保健品有限公司，中國)；TritonX-100(MP Biomedicals，美國)；PBS(Biosharp，中國)；即用型山羊血清(BOSTER，中國)；兔抗CtBP2抗體(1∶200，Abcam，英國)；山羊抗兔二抗(1∶200，Proteintech，美國)；含DAPI抗熒光淬滅封片液(Beyotime，中國)；音箱(廣州聲霸智能科技有限公司)；功放(廣州聲霸智能科技有限公司)；聲級計(jì)(廣州宏誠集業(yè)電子科技有限公司)；腦干誘發(fā)電位儀(Otometrics，丹麥)；體視顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)前對C57小鼠進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)檢測，篩選聽閾正常的小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。而后將小鼠隨機(jī)分為4組，每組30只，分別給予不同強(qiáng)度的噪聲暴露：105 dB 2 h，110 dB 2 h，110 dB 4 h，115 dB 4 h。將噪聲暴露前的小鼠作為對照組，根據(jù)噪聲暴露后不同時間點(diǎn)每組又分為4個亞組，即噪聲暴露后1 d組(NE-1 d)、噪聲暴露后7 d組(NE-7 d)、噪聲暴露后14 d組(NE-14 d)、噪聲暴露后28 d組(NE-28 d)。

1.2.2 噪聲暴露 將采集的我國航空兵部隊(duì)某型軍用直升機(jī)噪聲作為實(shí)驗(yàn)噪聲，將實(shí)驗(yàn)組小鼠置于鼠籠中，音箱位于鼠籠兩側(cè)，噪聲暴露前用聲級計(jì)測試噪聲強(qiáng)度，確保每只小鼠活動范圍內(nèi)聲壓級相差<3 dB。實(shí)驗(yàn)組小鼠接受相應(yīng)強(qiáng)度的噪聲刺激；對照組小鼠除不給予噪聲刺激，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.2.3 ABR測試 采用10 g/L戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)聯(lián)合10 mL/L速眠新Ⅱ(0.04 mL)腹腔注射小鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后清除雙耳耵聹。測試時將記錄電極插于小鼠顱頂正中雙耳連線中點(diǎn)皮下，參考電極插于雙耳耳后皮下，接地電極插于尾部正中。

實(shí)驗(yàn)采用短聲(click)和短純音作為刺激聲，刺激頻率為21次/s，濾波帶寬300～3 000 Hz，持續(xù)時間10 ms，疊加1 024次。短純音選取頻率點(diǎn)為1、2、4、8 kHz，刺激聲強(qiáng)度從80 dB SPL開始，以10 dB SPL為間隔遞減，直至辨認(rèn)不出Ⅲ波后，再向上檢測5 dB SPL，可辨認(rèn)出Ⅲ波的最低刺激聲強(qiáng)即為小鼠的聽力閾值。同時于click 80 dB SPL條件下記錄Ⅰ波波幅及Ⅰ波潛伏期。

1.2.4 耳蝸樣本取材 小鼠以頸椎脫臼法處死，斷頭，剪開顱骨，去除腦組織，取出耳蝸。將小鼠耳蝸置于盛有40 g/L多聚甲醛溶液的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下修剪去除多余骨質(zhì)和組織，去除鐙骨，開放卵圓窗。用注射器針頭在蝸頂打孔，將多聚甲醛溶液分別從蝸頂小孔和卵圓窗灌注入耳蝸，反復(fù)灌注3次。將灌注后的耳蝸放入盛有40 g/L多聚甲醛溶液的EP管內(nèi)，于4 ℃冰箱固定過夜。

將固定好的耳蝸放入100 g/L的EDTA中脫鈣3 d，每日更換新的EDTA溶液。將脫好鈣的耳蝸轉(zhuǎn)移到1×PBS溶液中，在體視顯微鏡下去除周圍骨質(zhì)、前庭膜和蓋膜，由蝸頂至蝸底分離并取下完整的耳蝸基底膜，修剪掉多余的組織后，切分為底回、二回、三回、頂回，置于96孔板內(nèi)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 免疫熒光染色 取出分離好的耳蝸基底膜，加入適量的10 mL/L Triton X-100打孔1 h，而后用1×PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min。使用即用型山羊血清室溫封閉1 h后，向樣本中加入兔抗CtBP2抗體(ab128871，Abcam，英國)，并于4 ℃冰箱孵育24 h，1×PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min。向每個孔內(nèi)加入適量的山羊抗兔二抗(cy3，SA00009-2，Proteintech，美國)，室溫下避光孵育2 h，1×PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min，使用移液管將基底膜移至載玻片上。在體視顯微鏡下區(qū)分正反后，正面朝上，濾紙吸干多余水分，滴上適量含DAPI的抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片。將封好的玻片置于黑盒內(nèi)，于4 ℃冰箱內(nèi)暫存。

1.2.6 共聚焦和帶狀突觸計(jì)數(shù) 使用共聚焦顯微鏡對耳蝸基底膜鋪片進(jìn)行觀察，選用的放大倍數(shù)為63倍的油鏡，激發(fā)光波長分別為405 nm和561 nm。從底回、二回、三回、頂回的每回基底膜選取1個視野進(jìn)行觀察并拍照，對視野內(nèi)CtBP2抗體特異性標(biāo)記的帶狀突觸進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的帶狀突觸平均數(shù)=視野內(nèi)帶狀突觸數(shù)量/內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 噪聲暴露前后ABR閾值變化

click處的ABR結(jié)果顯示，與對照組相比，105 dB 2 h軍用直升機(jī)噪聲暴露1 d后測得小鼠聽閾升高，但隨時間推移有所恢復(fù)，噪聲刺激前與刺激后各時間點(diǎn)聽閾變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；110 dB 2 h噪聲暴露1、7 d后測得小鼠聽閾明顯升高(P<0.01，P<0.05)，但隨時間推移逐漸恢復(fù)，至噪聲暴露后28 d可恢復(fù)至暴露前水平；110 dB 4 h和115 dB 4 h噪聲暴露1、7、14 d后測得小鼠聽閾出現(xiàn)明顯升高(P<0.01)，暴露后28 d后差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

NE-1 d：噪聲暴露后1 d組；NE-7 d：噪聲暴露后7 d組；NE-14 d：噪聲暴露后14 d組；NE-28 d：噪聲暴露后28 d組。n=12。aP<0.05，bP<0.01vs對照組。

圖1 噪聲刺激前后各組小鼠click處ABR閾值變化

1 kHz處ABR結(jié)果顯示，在4種噪聲暴露條件下，暴露后1 d小鼠該頻段聽閾均明顯升高(P<0.01)，110 dB 2 h噪聲后14 d可恢復(fù)至暴露前水平，105 dB 2 h和110 dB 4 h噪聲后28 d可恢復(fù)至暴露前水平，而115 dB 4 h噪聲后28 d仍不能恢復(fù)至暴露前水平(P<0.05，圖2A)。2 kHz處ABR結(jié)果顯示，105 dB 2 h、110 dB 4 h和115 dB 4 h噪聲后1 d小鼠該頻段聽閾均明顯升高(P<0.01)，105 dB 2 h噪聲后14 d、110 dB 4 h噪聲后28 d可恢復(fù)至暴露前水平，而115 dB 4 h噪聲后28 d仍不能恢復(fù)至暴露前水平(P<0.05)；110 dB 2 h噪聲后1 d小鼠該頻段聽閾有升高，但與暴露前聽閾無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2B)。4 kHz處ABR結(jié)果顯示，105 dB 2 h噪聲后小鼠該頻段聽閾與噪聲前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；110 dB 2 h、110 dB 4 h和115 dB 4 h噪聲后1 d小鼠該頻段聽閾均明顯升高(P<0.01)，110 dB 2 h噪聲后14 d、110 dB 4 h噪聲后28 d可恢復(fù)至暴露前水平，而115 dB 4 h噪聲后28 d仍不能恢復(fù)至暴露前水平(P<0.05，圖2C)。8 kHz處ABR結(jié)果顯示，105 dB 2 h噪聲后1 d小鼠該頻段聽閾明顯升高(P<0.05)，噪聲暴露后7 d即可恢復(fù)至暴露前水平；110 dB 2 h、110 dB 4 h和115 dB 4 h噪聲后1 d小鼠該頻段聽閾均明顯升高(P<0.01)，110 dB 2 h噪聲后14 d、110 dB 4 h噪聲后28 d可恢復(fù)至暴露前水平，而115 dB 4 h噪聲后28 d仍不能恢復(fù)至暴露前水平(P<0.05，圖2D)。

A：噪聲刺激前后各組小鼠1 kHz處ABR閾值變化；B：噪聲刺激前后各組小鼠2 kHz處ABR閾值變化；C：噪聲刺激前后各組小鼠4 kHz處ABR閾值變化；D：噪聲刺激前后各組小鼠8 kHz處ABR閾值變化。NE-1 d：噪聲暴露后1 d組；NE-7 d：噪聲暴露后7 d組；NE-14 d：噪聲暴露后14 d組；NE-28 d：噪聲暴露后28 d組。n=12。 aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組。

2.2 Ⅰ波波幅變化

各組噪聲暴露前后，click 80 dB SPL處Ⅰ波波幅變化情況見圖3。105 dB SPL軍用直升機(jī)噪聲暴露2 h，1 d后小鼠ABR Ⅰ波波幅明顯降低(P<0.05)，但在噪聲后28 d恢復(fù)至暴露前水平；110 dB 2 h、110 dB 4 h、115 dB 4 h組在噪聲暴露1 d后ABR Ⅰ波波幅明顯降低(P<0.01)，且至噪聲后28 d仍無法恢復(fù)至暴露前水平(P<0.05)。

NE-1 d：噪聲暴露后1 d組；NE-7 d：噪聲暴露后7 d組；NE-14 d：噪聲暴露后14 d組；NE-28 d：噪聲暴露后28 d組。ABR：聽性腦干反應(yīng)。n=12。 aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組。

2.3 Ⅰ波潛伏期變化

各組噪聲暴露前后click 80 dB SPL處Ⅰ波潛伏期變化情況見圖4。105 dB SPL軍事航空噪聲暴露2 h，噪聲后1 d小鼠ABRⅠ波潛伏期延長，但變化幅度較小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而后聽閾隨時間推移有所恢復(fù)；110 dB 2 h和110 dB 4 h噪聲暴露1 d后小鼠ABR Ⅰ波潛伏期延長(P<0.05)，至噪聲后28 d可恢復(fù)至暴露前水平；115 dB 4 h噪聲暴露后ABR Ⅰ波潛伏期同樣表現(xiàn)為先延長后恢復(fù)，但僅在噪聲暴露后7 d潛伏期與暴露前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

NE-1 d：噪聲暴露后1 d組；NE-7 d：噪聲暴露后7 d組；NE-14 d：噪聲暴露后14 d組；NE-28 d：噪聲暴露后28 d組。ABR：聽性腦干反應(yīng)。n=12。 aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組。

2.4 帶狀突觸計(jì)數(shù)

ABR檢測結(jié)果顯示，110 dB 2 h噪聲暴露后，小鼠的聽功能變化最符合HHL的聽力學(xué)表型。因此本研究進(jìn)一步使用DAPI染料標(biāo)記毛細(xì)胞核排列情況，使用熒光特異性標(biāo)記螺旋神經(jīng)節(jié)與內(nèi)毛細(xì)胞間的突觸前膜蛋白CtBP2對帶狀突觸進(jìn)行計(jì)數(shù)，以從形態(tài)學(xué)角度驗(yàn)證該模型的有效性。帶狀突觸數(shù)量在噪聲暴露后1 d明顯降低，而后隨著時間的推移有所恢復(fù)(圖5)。

NE-1 d：噪聲暴露后1 d組；NE-7 d：噪聲暴露后7 d組；NE-14 d：噪聲暴露后14 d組；NE-28 d：噪聲暴露后28 d組。

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，整個耳蝸的帶狀突觸密度明顯下降，但不同位置的帶狀突觸密度下降程度不同(圖6)。

NE-1 d：噪聲暴露后1 d組；NE-7 d：噪聲暴露后7 d組；NE-14 d：噪聲暴露后14 d組；NE-28 d：噪聲暴露后28 d組。n=6。 aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組。

底回帶狀突觸密度在噪聲暴露前為(15.03±0.70)個，暴露后1 d降至(9.62±0.62)個，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，至噪聲后28 d仍無法恢復(fù)至暴露前水平(P<0.01)；二回帶狀突觸密度由噪聲暴露前的(19.66±1.05)個降至暴露后1 d的(9.09±0.99)個，差異顯著(P<0.01)，且至噪聲后28 d仍無法恢復(fù)至暴露前水平(P<0.01)；三回帶狀突觸密度噪聲暴露前為(16.65±0.95)個，暴露后1 d降至(6.95±0.41)個，下降顯著(P<0.01)，至噪聲后28 d仍無法恢復(fù)至暴露前水平(P<0.01)；頂回帶狀突觸密度噪聲暴露前為(11.77±0.69)個，暴露后1 d降至(7.47±0.48)個，下降顯著(P<0.01)，且至噪聲暴露后28 d仍無法恢復(fù)至暴露前水平(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，噪聲暴露后耳蝸的帶狀突觸密度明顯下降，且隨時間推移均無法恢復(fù)至暴露前水平，但位置不同下降幅度有所差異。

3 討論

近年來，隨著新型武器裝備的發(fā)展，軍事噪聲所致聽力損失的發(fā)病率大幅升高，軍人由于其職業(yè)特殊性，常需長期暴露在不同類型軍用裝備產(chǎn)生的噪聲環(huán)境中，極易導(dǎo)致不同程度的聽力損失[11]。HHL作為近年來的研究熱點(diǎn)，其病理基礎(chǔ)主要是帶狀突觸受損和毛細(xì)胞功能異常，但確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[12]。與以往研究較多的噪聲性耳聾不同，HHL主觀檢查上不存在聽力障礙，但這種聽力的隱匿性損害可以在耳蝸中積累，一方面導(dǎo)致其對耳毒性藥物、老齡化等耳損傷因素易感性增加，另一方面其可表現(xiàn)為言語分辨率差、耳鳴和聽覺敏感等，對生活和工作造成顯著影響[13]。

ABR是通過頭皮電極記錄的從內(nèi)耳耳蝸到大腦皮層聽覺中樞不同平面對于瞬態(tài)聲刺激信號的一系列短潛伏期聽覺誘發(fā)反應(yīng)。這些反應(yīng)波通常在受刺激后10 ms內(nèi)出現(xiàn)，其中Ⅰ波、Ⅲ波及Ⅴ波最易辨別，且出現(xiàn)率較高，以往文獻(xiàn)中多用Ⅲ波出現(xiàn)的最小噪聲刺激強(qiáng)度作為小鼠的聽閾[14]。本研究分別檢測并比較各組噪聲暴露前后click，1、2、4、8 kHz處ABR閾值，同時記錄click 80 dB SPL處ABR Ⅰ波波幅和Ⅰ波潛伏期。結(jié)果顯示，各噪聲暴露條件后小鼠均表現(xiàn)為ABR Ⅰ波波幅降低和Ⅰ波潛伏期延長，但click處聽閾變化各不相同。105 dB 2 h軍用直升機(jī)噪聲暴露后C57小鼠聽閾無顯著性閾移；110 dB 4 h和115 dB 4 h軍用直升機(jī)噪聲暴露后小鼠聽閾發(fā)生永久性閾移；而110 dB 2 h噪聲暴露后C57小鼠聽閾則發(fā)生暫時性閾移，符合HHL的聽閾變化特征。而由于小鼠在不同頻率下的聽閾特點(diǎn)不同，雖然1、2、4、8 kHz處的小鼠噪聲后聽閾變化趨勢與click處相同，但噪聲對小鼠聽閾中高頻段影響更顯著，且較低頻段處(1、2 kHz)數(shù)據(jù)易受干擾，波動較大，導(dǎo)致部分結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在此后研究中將盡量排除ABR測試時環(huán)境的干擾因素，同時增大樣本數(shù)量，以明確較低頻處小鼠聽閾的差異和變化情況。

耳蝸帶狀突觸是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞與Ⅰ型聽神經(jīng)纖維末梢間的突觸連接，負(fù)責(zé)聲音信號向中樞的高效傳輸。研究表明，噪聲暴露后耳蝸帶狀突觸的病變包括數(shù)量減少、形態(tài)異常、位置改變等[15]。本研究通過比較噪聲暴露前后耳蝸帶狀突觸密度的改變，驗(yàn)證110 dB 2 h軍事航空噪聲暴露建立軍事航空噪聲性HHL C57小鼠模型的有效性。結(jié)果表明，110 dB 2 h軍用直升機(jī)噪聲暴露后，耳蝸基底膜不同部位的帶狀突觸密度均出現(xiàn)明顯下降，但處于不同位置的帶狀突觸數(shù)量下降幅度有所差異，符合HHL的內(nèi)耳形態(tài)學(xué)變化特征。由此我們認(rèn)為，110 dB SPL軍用直升機(jī)噪聲暴露2 h可作為軍事航空噪聲性HHL C57小鼠模型的理想建模參數(shù)。

本研究通過比較多種噪聲暴露條件后C57小鼠聽功能和內(nèi)耳形態(tài)學(xué)的變化特征，確定了C57小鼠軍事航空噪聲性HHL模型的理想刺激條件，成功構(gòu)建了軍事航空噪聲性HHL C57小鼠模型，為今后進(jìn)一步開展軍事航空噪聲性HHL的致病機(jī)制和防護(hù)措施的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。