常 瑋，李亞娟，臧克海，李少華，劉美杰，劉峰舟，4，薛軍輝，4

(空軍軍醫(yī)大學(xué)：1航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天臨床醫(yī)學(xué)中心，2航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天生理學(xué)教研室，3航空航天醫(yī)學(xué)系飛行人員療養(yǎng)與康復(fù)教研室，4西京醫(yī)院空勤科，陜西 西安 710032)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)每年出于生活、援建以及執(zhí)行軍事任務(wù)等目的進(jìn)入高原的人員超過(guò)3 000萬(wàn)[1]。急進(jìn)高原(海拔超過(guò)1 000 m)并進(jìn)行相關(guān)作業(yè)對(duì)于長(zhǎng)期生活在平原地區(qū)的人員來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)[2]。因?yàn)榘l(fā)病機(jī)制尚不明確，所以不同程度的低氣壓缺氧腦損傷在急進(jìn)高原人群中的發(fā)生率很高且尚無(wú)很好的防治措施。目前已有研究證實(shí)血管屏障破壞以及腦血流增加所引起的血管源性水腫是低氣壓缺氧腦損傷發(fā)生發(fā)展的主要原因[3]。腦血管平滑肌作為腦血管壁的重要組成部分，在維持大腦血管的正常功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。然而，在急性低氣壓缺氧環(huán)境下，腦血管平滑肌細(xì)胞(cerebrovascular smooth muscle cells，CVSMCs)會(huì)發(fā)生怎樣的功能改變進(jìn)而影響低氣壓缺氧腦損傷的發(fā)生發(fā)展還有待進(jìn)一步研究。本研究觀察了低氣壓缺氧條件下的腦損傷以及腦血管平滑肌功能結(jié)構(gòu)的變化，并對(duì)小鼠腦血管平滑肌原代細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，為闡明低氣壓缺氧腦損傷的發(fā)生機(jī)制提供了新的思路，對(duì)于尋找有效的防治策略、降低低氣壓缺氧腦損傷的發(fā)生率具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)采用6周齡左右雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。領(lǐng)取小鼠后，將動(dòng)物飼養(yǎng)溫度控制在20～25 ℃，實(shí)驗(yàn)室明暗交替時(shí)間為12 h∶12 h，自由進(jìn)食與飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[許可證號(hào)：SCXK(軍)2017-0021]。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其中20只小鼠隨機(jī)分為平原組(Sham組)以及高原組(HA組)，每組10只。另取20只C57BL/6J小鼠進(jìn)行原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 Ham’s F-12培養(yǎng)基(#31765035，GbicoTM，美國(guó))，胎牛血清(#10099-141，GbicoTM，美國(guó))，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(YT5797，Immunoway，美國(guó))，通用型抗體稀釋液(WB500D，新賽美，中國(guó))，杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)(#14190144，GibcoTM，美國(guó))，Ⅱ型膠原酶(#9001-12-1，Sigma-Aldrich，美國(guó))，2.5 g/L胰蛋白酶(#C0208-100 mL，碧云天，中國(guó))，TRIzol試劑(#15596026，Invitrogen，美國(guó))，RIPA裂解液(#P0013B，碧云天，中國(guó))，10×TBST緩沖液(#T1081，索萊寶，中國(guó))，Calponin 1抗體(#bs-0095R，博奧森，中國(guó))，β-tubulin抗體(#10094-1-AP，武漢三鷹)，血管平滑肌22α(smooth muscle 22α，SM22α)抗體(#60213-1-Ig，武漢三鷹)，QubitTM RNA檢測(cè)試劑盒(#Q10210，Life Technologies，美國(guó))，KCTM Stranded mRNA Library Prep Kit for Illumina?建庫(kù)試劑盒(#DR08402，南寧核利科技)，TRIzol(#B610409，上海生工)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#B639277，上海生工)，SYBR Green染料法Mix(#B110031，上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 根據(jù)JING等[5]關(guān)于高原腦水腫造模研究，我們將HA組小鼠放入小型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用環(huán)境模擬艙(由空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系與宏遠(yuǎn)氧業(yè)股份有限公司聯(lián)合研制)，以5～10 m/s速度升至模擬海拔6 000 m，并在該條件下連續(xù)暴露5 d后，以10～15 m/s速度降至地面高度。Sham組小鼠置于當(dāng)?shù)?西安)海拔約400 m進(jìn)行飼養(yǎng)。兩組動(dòng)物均給予充足的食物與水。

1.2.2 HE染色 模型制備完成后對(duì)所有小鼠進(jìn)行小鼠脫頸處死，在冰上迅速分離小鼠大腦，并將其放入用0.1 mol/L PBS配制的含40 g/L多聚甲醛溶液中固定1周，按常規(guī)處理制備石蠟切片，常溫保存?zhèn)溆谩Ｈ旧皩⑹炃衅Ｒ?guī)脫蠟至水，然后依次進(jìn)行蘇木素染色(10 min)、鹽酸乙醇分化(2 s)、自來(lái)水洗返藍(lán)(3 min)、伊紅染色(3 min)、流水沖洗(1 min)、分化液分化(10 s)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明以及中性樹(shù)膠封片，最后將切片放置顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.3 免疫組織化學(xué)技術(shù) ①取石蠟切片，60 ℃烤片1 h，脫蠟復(fù)水；②熱修復(fù)法修復(fù)抗原；③山羊血清封閉室溫60 min；④滴加α-SMA抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過(guò)夜；⑤PBS沖洗3次；⑥滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶200稀釋)室溫孵育1 h；⑦DAB鏡下顯色、蘇木素復(fù)染；⑧切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥；⑨中性樹(shù)膠封固，晾干后顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blotting檢測(cè) ①頸椎脫臼法處死小鼠后將其放入預(yù)先配好的750 mL/L乙醇中浸泡5 min；②快速斷頭取腦放入含有100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的預(yù)冷DPBS溶液中；③在體視顯微鏡直視下迅速分離大腦底部動(dòng)脈(包括Willis環(huán)及其分支)；④加入RIPA裂解液，冰上孵育20 min，在4 ℃下12 500 r/min離心20 min，取上清液；⑤采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；⑥加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min；⑥按每孔50 μg上樣，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在50 g/L脫脂奶粉中室溫封閉1 h；⑦按說(shuō)明書(shū)配置并加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；⑧加相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；⑨采用Vilber Fusion FX Spectra設(shè)備進(jìn)行條帶顯影以及灰度值分析。

1.2.5 小鼠腦血管平滑肌原代細(xì)胞提取 ①分離小鼠大腦底部動(dòng)脈，方法同上；②將分離的動(dòng)脈放于含100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的PBS中漂洗數(shù)次；③將動(dòng)脈移入1 g/L的Ⅱ型膠原酶溶液中，用滴管輕輕吹打1 min左右；④置于CO2培養(yǎng)箱中，消化15 min，每5 min取出并用滴管輕輕吹打30 s左右；⑤待動(dòng)脈消化成絮狀物，加入含100 mL/L胎牛血清的Ham’s F-12培養(yǎng)基終止酶解反應(yīng)，并將其放入離心機(jī)，按1 500 r/min離心5 min，棄上清；⑥重新加入DPBS溶液吹打，離心，棄上清，洗掉殘余膠原酶；⑦加入含200 mL/L胎牛血清、100 mg/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素的Ham’s F-12培養(yǎng)基，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；⑧1周左右時(shí)間細(xì)胞融合生長(zhǎng)，約長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80%，即可傳代培養(yǎng)。

1.2.6 細(xì)胞的傳代及純化 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶分離消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。由于腦血管直徑小，內(nèi)膜和纖維外層不易去除。因此，在細(xì)胞傳代過(guò)程中，可以根據(jù)成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的不同消化時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。在細(xì)胞消化過(guò)程中，成纖維細(xì)胞在平滑肌細(xì)胞之前從細(xì)胞壁上分離出來(lái)，因此，這種差異可以用于純化。在傳代過(guò)程中，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化過(guò)程，20～30 s后，將消化下分離出來(lái)的細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞)和消化液在20～30 s內(nèi)丟棄，然后再加入胰蛋白酶完成傳代過(guò)程。此外，血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量明顯多于成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。因此，平滑肌細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中具有增殖優(yōu)勢(shì)，這種優(yōu)勢(shì)可以抑制其他細(xì)胞的增殖。

1.2.7 細(xì)胞缺氧模型建立 ①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第三代小鼠腦血管平滑肌原代細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱中(10 mL/L O2、50 mL/L CO2、940 mL/L N2，37 ℃)缺氧處理24 h，建立細(xì)胞缺氧模型組(Hypoxia組)；②常氧培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組(Control組)。

1.2.8 RNA提取及文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序 按照CHOMCZYNSKI等[6]的方法，使用TRIzol試劑從Control和Hypoxia組的小鼠腦血管平滑肌原代細(xì)胞中分別提取總RNA。RNA質(zhì)量通過(guò)使用NanoDropTMOne C分光光度計(jì)(賽默飛有限公司)檢測(cè)A260 nm/A280 nm來(lái)確定。通過(guò)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)RNA完整性。最終通過(guò)Qubit 3.0熒光定量?jī)x和相應(yīng)的QubitTMRNA檢測(cè)試劑盒對(duì)合格的RNA(A260 nm/A280 nm：1.8～2.2，RQN值>7.0)進(jìn)行定量。使用RNA鏈特異性建庫(kù)試劑盒將2 μg的總RNA用于建庫(kù)。將構(gòu)建好的文庫(kù)在DNBSEQ-T7測(cè)序平臺(tái)(華大基因)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 以RPKM值作為基因表達(dá)量的衡量指標(biāo)。以∣log2(fold change)∣>1且P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)，表示該基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。通過(guò)DAVID平臺(tái)對(duì)篩選出的樣品間DEGs進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路顯著性富集分析。

1.2.10 qRT-PCR驗(yàn)證 用TRIzol提取總RNA，然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用SYBR Green染料法Mix進(jìn)行qRT-PCR。用β-actin來(lái)歸一化這些基因的表達(dá)，用2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)值。從PrimerBank40中檢索到引物序列(表1)，引物特異性用國(guó)家生物技術(shù)信息中心引物BLAST工具進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 原始測(cè)序數(shù)據(jù)首先由Trimmomatic(版本0.36)過(guò)濾，低質(zhì)量的讀取被丟棄，被適配器序列污染的讀取被修剪。使用帶有默認(rèn)參數(shù)的STRA軟件(版本2.5.3a)將干凈的數(shù)據(jù)映射到Mus_musculus的參考基因組[參考基因組版本Mus_musculus. GRCm38(NCBI)]。通過(guò)featureCounts(Bioconductor)計(jì)算映射到每個(gè)基因外顯子區(qū)域的讀數(shù)，然后計(jì)算RPKMs。使用edgeR包(版本3.12.1)鑒定各組間DEGs。以∣log2(fold change)∣>1且P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷DEGs的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)KOBAS軟件(版本2.1.1)進(jìn)行DEGs的GO分析和KEGG富集分析，P<0.05表示顯著富集。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Graghpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)量資料的兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模擬高原環(huán)境導(dǎo)致小鼠腦血管收縮功能改變

通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，HA組小鼠大腦細(xì)胞的組織間隙明顯變寬且皮層血管擴(kuò)張明顯，可見(jiàn)神經(jīng)元萎縮以及核深染。腦組織免疫組化以及免疫熒光檢測(cè)小鼠腦組織中平滑肌細(xì)胞收縮功能標(biāo)記分子α-SMA的表達(dá)[7]，發(fā)現(xiàn)HA組α-SMA的表達(dá)較Sham組下降。分離兩組小鼠大腦底部動(dòng)脈(包括Willis環(huán)及其分支)并進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)缺氧暴露下，小鼠腦血管平滑肌與收縮功能相關(guān)蛋白α-SMA、Calponin 1、SM22α表達(dá)下降。提示低氣壓缺氧環(huán)境下，小鼠腦血管平滑肌收縮功能發(fā)生改變(圖1)。

2.2 小鼠原代CVSMCs鑒定

小鼠原代CVSMCs由組織塊緩慢爬出，約14 d后觀察到細(xì)胞呈典型的峰谷狀生長(zhǎng)模式。用血管平滑肌特異性標(biāo)記蛋白α-SMA進(jìn)行免疫熒光染色，此外，細(xì)胞核用DAPI復(fù)染，圖像合并。熒光顯微鏡下可見(jiàn)血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)呈紅色，胞核呈藍(lán)色(圖2)。

A：小鼠CVSMCs(×100)；B：小鼠CVSMCs α-SMA免疫熒光染色(×200)；C：小鼠CVSMCs DAPI染色(×200)；D：小鼠CVSMCs染色混合圖(×200)。CVSMCs：腦血管平滑肌細(xì)胞；α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。

2.3 基因表達(dá)差異分析

聚類熱圖顯示了Hypoxia組和Control組之間基因表達(dá)譜的差異。為了確定這些基因在缺氧環(huán)境中的差異表達(dá)，我們使用火山圖分析了兩組之間的變化。通過(guò)比較Hypoxia組和Control組之間的DEGs，以∣log2(fold change)∣>1、P<0.05篩選顯著的DEGs，隨后獲得511個(gè)DEGs，其中298個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，213個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖3)。

A：Hypoxia組和Control組DEGs的熱圖，以RPKM值進(jìn)行聚類，紅色表示高表達(dá)基因，藍(lán)色表示低表達(dá)基因；B：Hypoxia組和Control組基因表達(dá)的火山圖，灰色點(diǎn)代表未發(fā)生差異表達(dá)的基因，藍(lán)色點(diǎn)代表差異下調(diào)的基因，紅色點(diǎn)代表差異上調(diào)的基因；C：Hypoxia組和Control組DEGs上、下調(diào)數(shù)目統(tǒng)計(jì)。Hypoxia組：缺氧模型組；Control組：對(duì)照組。DEGs：差異表達(dá)基因；log2(fold change)：差異倍數(shù)以2為底的對(duì)數(shù)；-log10(P-value)：P值以10為底的負(fù)對(duì)數(shù)。

2.4 DEGs的GO富集分析

對(duì)Hypoxia組與Control組篩選出來(lái)的顯著性DEGs進(jìn)行GO富集分析，以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。GO富集分析主要包括3個(gè)部分，分別是生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。通過(guò)GO富集分析結(jié)果可以看出，DEGs中的上調(diào)基因在生物學(xué)過(guò)程模塊中，主要富集在線粒體蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程、糖酵解過(guò)程、線粒體外膜通透性等；分子功能模塊中，上調(diào)的DEGs主要富集在磷酸丙酮酸水合酶活性和脫氫抗壞血酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等；下調(diào)的DEGs在生物學(xué)過(guò)程中表達(dá)量顯著性差異較大的基因主要富集在共生體對(duì)宿主的黏附、核糖核酸酶活性的調(diào)節(jié)以及對(duì)Ⅰ型干擾素的應(yīng)答；分子功能模塊中，下調(diào)基因主要富集在2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性以及CCR5趨化因子受體結(jié)合等方面。我們按P值排序選擇最顯著的前20個(gè)GO Terms作圖(圖4)。

A：Hypoxia組和Control組上調(diào)DEGs的GO富集圖；B：Hypoxia組和Control組下調(diào)DEGs的GO富集圖。橫軸表示富集的顯著性[用-log10(P-value)表示，該值越大富集得越顯著]，縱軸表示富集的GO Terms，圓點(diǎn)大小表示該GO Terms包含的差異基因數(shù)目，圓點(diǎn)深淺表示rich factor富集的程度。Hypoxia組：缺氧模型組；Control組：對(duì)照組。DEGs：差異表達(dá)基因。

2.5 DEGs的KEGG通路分析

對(duì)Hypoxia組和Control組篩選出來(lái)的顯著性DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，判斷基因富集的閾值為P<0.05。在KEGG富集分析中，上調(diào)的DEGs基因富集最多的類別為糖酵解/糖異生，其次為新霉素、卡那霉素和慶大霉素生物合成、氨基酸的生物合成以及淀粉和蔗糖代謝。與此同時(shí)，對(duì)于下調(diào)的DEGs而言，RIG-I樣受體信號(hào)通路、丙型肝炎、甲型流感以及麻疹均富集顯著。我們按P值排序選擇最顯著的前20個(gè)KEGG Pathways作圖(圖5)。

A：Hypoxia組和Control組上調(diào)DEGs的KEGG代謝通路圖；B：Hypoxia組和Control組下調(diào)DEGs的KEGG代謝通路圖。橫軸表示富集的顯著性[用-log10(P-value)表示，該值越大富集得越顯著]，縱軸表示富集的KEGG Pathways，圓點(diǎn)大小表示該KEGG通路包含的差異基因數(shù)目，圓點(diǎn)深淺表示rich factor富集的程度。Hypoxia組：缺氧模型組；Control組：對(duì)照組。DEGs：差異表達(dá)基因。

2.6 利用qRT-PCR驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)

為了驗(yàn)證我們研究中獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，我們選擇了4個(gè)表達(dá)差異較大的DEGs進(jìn)行驗(yàn)證，包括Aire、Ndufa4l2、Gpr35以及Tnfrsf9(圖6)。結(jié)果提示RNA-seq數(shù)據(jù)可靠。

Control組：對(duì)照組；Hypoxia組：缺氧模型組。DEGs：差異表達(dá)基因。條形代表組。

3 討論

本研究通過(guò)構(gòu)建低氣壓缺氧動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)小鼠腦血管平滑肌在低氣壓缺氧暴露下的功能結(jié)構(gòu)變化。然后分離小鼠腦血管平滑肌原代細(xì)胞構(gòu)建缺氧模型進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出DEGs后進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并使用qRT-PCR進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)小鼠CVSMCs可通過(guò)改變能量代謝、物質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)途徑在低氣壓缺氧腦損傷中發(fā)揮作用。

通過(guò)HA組以及Sham組的比較，發(fā)現(xiàn)HA組小鼠的腦細(xì)胞間隙明顯變寬且出現(xiàn)腦神經(jīng)元損傷。免疫組化以及免疫熒光檢測(cè)小鼠腦組織中平滑肌細(xì)胞收縮功能標(biāo)記分子α-SMA的表達(dá)，提示低氣壓缺氧可能導(dǎo)致血管平滑肌收縮功能改變。我們進(jìn)一步分離兩組小鼠腦血管并進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)平滑肌特異性收縮功能相關(guān)蛋白α-SMA，Calponin 1以及SM22α在缺氧暴露后表達(dá)下降。以上實(shí)驗(yàn)均提示低氣壓缺氧環(huán)境下，小鼠腦神經(jīng)元的損傷伴隨著腦血管平滑肌收縮功能的改變。因?yàn)橹饕裳芷交〖?xì)胞承擔(dān)的腦血管收縮舒張功能在缺氧腦損傷中發(fā)揮重要作用，并且相關(guān)機(jī)制尚不明確[8]。因此，缺氧導(dǎo)致CVSMCs功能改變的機(jī)制值得進(jìn)一步的研究及探討。

通過(guò)對(duì)Hypoxia組和Control組小鼠原代CVSMCs進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共發(fā)現(xiàn)511個(gè)DEGs，其中298個(gè)上調(diào)基因，213個(gè)下調(diào)基因。對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG的功能分類分析。其中GO功能分析結(jié)果顯示，DEGs主要參與線粒體蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程、糖酵解過(guò)程、磷酸丙酮酸水合酶活性以及核糖核酸酶活性的調(diào)節(jié)等方面。通過(guò)KEGG富集分析，DEGs主要參與糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、RIG-I樣受體信號(hào)通路等。為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們?cè)谒蠨EGs中篩選出表達(dá)差異較大的4個(gè)分子進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，分別是Aire、Ndufa4l2、Gpr35以及Tnfrsf9。Aire與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，它可以促進(jìn)胸腺中各種組織特異性抗原的表達(dá)[9]。AIRE可與多種蛋白合作發(fā)揮核轉(zhuǎn)運(yùn)、染色質(zhì)結(jié)合/結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和前體mRNA加工等功能[10]。缺氧條件下，Aire的表達(dá)改變可能從以上幾個(gè)方面影響血管平滑肌細(xì)胞的功能。NDUFA4L2作為線粒體復(fù)合物Ⅰ的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，缺氧條件下的過(guò)表達(dá)可以減少因細(xì)胞活性氧增多而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，這一過(guò)程在腫瘤細(xì)胞上得到了印證[11]。GPR35可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境刺激新鮮血管的生成[12]。目前，有研究表明GPR35是Na/K-ATPase離子泵功能和Src信號(hào)活性的關(guān)鍵啟動(dòng)子，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展以及炎癥和能量代謝方面都發(fā)揮重要作用[13]。TNFRSF9又稱為4-1BB或CD137，是一種在多種細(xì)胞上表達(dá)的共刺激受體。目前研究認(rèn)為，TNFRSF9是腫瘤反應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的激活標(biāo)志物[14]。TNFRSF9的激活可刺激T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而提高機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答水平[14]。此外有研究表明，對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞而言，TNFRSF9的激活可通過(guò)降低抗凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2并隨后上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白酶cleaved caspase-3來(lái)增加細(xì)胞的凋亡[15]。作為靶向抗腫瘤藥物研發(fā)的“明星分子”，與之相關(guān)的研究大都圍繞腫瘤細(xì)胞進(jìn)行。對(duì)于非腫瘤細(xì)胞，TNFRSF9的研究并不多見(jiàn)。但值得注意的是，Tnfrsf9與炎癥、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面均密切相關(guān)，這些作用在非腫瘤細(xì)胞上的研究還有待開(kāi)展[16]。

通過(guò)本項(xiàng)目，我們發(fā)現(xiàn)缺氧暴露對(duì)小鼠CVSMCs的線粒體相關(guān)功能影響顯著。線粒體對(duì)于真核細(xì)胞的能量代謝、物質(zhì)代謝以及信號(hào)傳導(dǎo)等方面均發(fā)揮著重要作用[17]；并且線粒體的結(jié)構(gòu)和功能改變與許多疾病密切相關(guān)(如阿爾茨海默病、顱腦創(chuàng)傷、癲癇)[18]。最近的功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了線粒體蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜性[19-20]。承擔(dān)線粒體呼吸作用、代謝物運(yùn)輸、膜結(jié)構(gòu)調(diào)控等功能的蛋白質(zhì)之間存在相互聯(lián)系，并在一個(gè)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)中相互作用[20]。缺氧對(duì)線粒體蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程的改變可能會(huì)從以上多個(gè)方面對(duì)小鼠CVSMCs線粒體功能產(chǎn)生影響。糖酵解是所有生物體進(jìn)行葡萄糖分解代謝所必須經(jīng)過(guò)的共同階段，其全部反應(yīng)過(guò)程均在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行[21]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)糖酵解和氧化磷酸化之間的轉(zhuǎn)換來(lái)適應(yīng)代謝環(huán)境的改變[22-24]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于小鼠CVSMCs而言，微環(huán)境的變化同樣會(huì)造成細(xì)胞糖代謝相關(guān)途徑的變化。磷酸丙酮酸水合酶是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在各個(gè)組織器官中的表達(dá)豐富，其作用是使2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖帷Ｈ毖跚闆r下，磷酸丙酮酸水合酶活性的改變會(huì)大大影響細(xì)胞的糖代謝[25]。細(xì)胞核糖核酸酶活性在缺氧暴露下的改變意味著小鼠CVSMCs的能量代謝、物質(zhì)代謝以及對(duì)有害物質(zhì)的防御機(jī)制發(fā)生了變化[26-27]。小鼠CVSMCs參與糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、RIG-I樣受體信號(hào)通路的基因在缺氧條件下會(huì)發(fā)生改變，提示缺氧對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能均產(chǎn)生顯著影響，尤其是涉及能量代謝、物質(zhì)代謝和信號(hào)傳導(dǎo)方面。以上這些變化都將進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)急性低氣壓缺氧暴露會(huì)導(dǎo)致腦血管平滑肌功能結(jié)構(gòu)的改變；同時(shí)，這種改變可能不同程度上參與了低氣壓缺氧腦損傷的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)對(duì)小鼠CVSMCs缺氧處理并進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)缺氧會(huì)導(dǎo)致小鼠CVSMCs糖代謝相關(guān)途徑發(fā)生明顯改變。這種能量代謝途徑的變化對(duì)于低氣壓缺氧腦損傷而言是一種保護(hù)機(jī)制還是損害機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。不論是能量代謝、物質(zhì)代謝還是信號(hào)傳導(dǎo)，線粒體都在其中發(fā)揮著重要作用，血管平滑肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)是否在缺氧暴露下發(fā)生改變還有待進(jìn)一步證明。不可否認(rèn)的是，該研究存在一定的局限性。首先，因?qū)嶒?yàn)條件有限，實(shí)驗(yàn)室無(wú)法同時(shí)滿足低溫低壓的模擬高原環(huán)境。對(duì)于低氣壓缺氧腦損傷而言，高海拔導(dǎo)致的低氣壓缺氧雖在其中發(fā)揮重要作用，但不能忽視高海拔溫度變化對(duì)機(jī)體帶來(lái)的影響。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，更加準(zhǔn)確地模擬高原環(huán)境將更有利于對(duì)低氣壓缺氧腦損傷的研究。其次，未對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行更詳細(xì)的大腦功能檢測(cè)以及施加相應(yīng)的干預(yù)措施，這將在今后更深入的研究中進(jìn)行。