王振昱，蘇秀娟

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000；2.新疆作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000）

薰衣草（LavandulaangustifoliaM.）為多年生的亞灌木，是一種觀(guān)賞價(jià)值較高的天然香料植物，具有濃郁的芳香氣味[1]。由薰衣草花穗提煉而獲得的植物精油是一種揮發(fā)性精油，其主要成分為芳樟醇等萜類(lèi)化合物[2]。萜類(lèi)化合物合成途徑包括6個(gè)酶反應(yīng)步驟組成的甲羥戊酸途徑（MVA）和7 個(gè)酶反應(yīng)步驟組成的甲基赤蘚糖醇磷酸途徑（MEP），其中MVA 途徑主要合成倍半萜和三萜，而MEP 途徑參與合成單萜和二萜等次生代謝產(chǎn)物[3]。DXR為MEP 途徑中第二步催化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，催化DXP轉(zhuǎn)化為MEP，是調(diào)控植物萜類(lèi)物質(zhì)生物合成的有效靶點(diǎn)。

DXR基因在多種植物中被克隆并分離出來(lái)，隨著研究的深入，DXR基因的功能及調(diào)控機(jī)制也越來(lái)越明確。過(guò)表達(dá)藍(lán)藻DXR基因能夠引起轉(zhuǎn)基因煙草中葉綠素a、β-谷甾醇增加[4]；過(guò)表達(dá)DXR基因的薄荷葉片中的揮發(fā)油含量對(duì)比野生型植株提高了50%[5]。因此，通過(guò)基因工程技術(shù)手段增加萜類(lèi)合成酶基因的表達(dá)量，是提高植物萜類(lèi)化合物產(chǎn)量的有效途徑。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)DXR基因的煙草植株，采用熒光定量技術(shù)確定了其在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量，利用GC-MS技術(shù)測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株葉片中萜類(lèi)揮發(fā)物的含量情況，初步明確了薰衣草DXR基因的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以普通煙草（NicotianatabacumL.）為材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草葉片侵染

將含有pCAMBIA3301-DXR質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液在添加50 mg/mL 卡那霉素和利福平的YEB 培養(yǎng)液中28 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后，接入新鮮YEB培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD 值為1.0～1.2，4 000 r/min 離心10 min，MS 液體培養(yǎng)基重懸菌液OD 值為0.6～0.8。將煙草葉片切成0.5 cm×0.5 cm 小塊，放入農(nóng)桿菌重懸菌液中浸泡15 min，取出葉片置于無(wú)菌濾紙上吸干殘液，將其接種在葉片分化培養(yǎng)基（鋪一層濾紙）中28 ℃暗培養(yǎng)2 d后，將其接種于篩選培養(yǎng)基。待葉片分化出的抗性芽生長(zhǎng)至1.5 cm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定及表達(dá)量分析

使用改良CTAB 法提取煙草基因組DNA，用DXRF（ATGGCTCTTAATTTGACGTCTCC）和DXR-R（TTAG ACAAGAGCGGGAGTACTCAAA）引物組合檢測(cè)過(guò)表達(dá)DXR基因的煙草植株。提取煙草總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將其稀釋至100～200 ng/μL。以Actin 為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)，反應(yīng)程序選用兩步法：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct 法計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的萜類(lèi)揮發(fā)物測(cè)定

選取生長(zhǎng)狀況良好的野生型及轉(zhuǎn)基因植株葉片，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)樣品成分進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草抗性植株的PCR鑒定

以抗性煙草小苗葉片DNA 為模板，經(jīng)DXR-F 和DXR-R 特異引物組合的PCR 檢測(cè)，10 株抗性植株中均含有與目的基因大小一致的條帶，如圖1 所示，條帶清晰且單一，初步證明該基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草中。

圖1 DXR轉(zhuǎn)基因抗性煙草PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of DXR transgenic resistant tobacco

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草中DXR基因的表達(dá)量分析

提取陽(yáng)性煙草植株的RNA，檢測(cè)DXR基因表達(dá)量。結(jié)果表明，DXR基因在轉(zhuǎn)基因株系中均有表達(dá)，其表達(dá)水平存在株系間差異，其中該基因在OE-2、OE-3、OE-4、OE-13、OE-14、OE-18、OE-19、OE-20 表達(dá)量明顯高于其在野生型煙草中的表達(dá)量，具體情況如圖2 所示，分別為41.45 倍、19.57 倍、100.9 倍、31.94 倍、135.9 倍、101.69倍、97.76倍、89.15倍。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草DXR的表達(dá)量檢測(cè)Fig.2 Detection of DXR expression in transgenic tobacco

圖3 DXR轉(zhuǎn)基因煙草株系單萜化合物含量情況Fig.3 Contents of monoterpene compounds in DXR transgenic tobacco lines

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草花香萜類(lèi)物質(zhì)的分析

未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的表型有明顯差異。選取DXR基因表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)基因煙草株系OE-14和野生型植株為樣本，比較其萜類(lèi)物質(zhì)含量的差異。轉(zhuǎn)基因煙草中單萜揮發(fā)物含量占揮發(fā)物總量的4.3%，其含量顯著高于對(duì)照，比對(duì)照高出1.42 倍。具體情況如圖所示，過(guò)表達(dá)DXR基因并未引起煙草中二萜化合物含量發(fā)生變化。因此，過(guò)表達(dá)DXR基因可以提高轉(zhuǎn)基因植株的單萜化合物含量。

3 討論

萜類(lèi)化合物一般由多個(gè)異戊二烯（C5）單元組成，按照萜類(lèi)化合物在植物中發(fā)揮的不同作用，可以被分為初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物兩大類(lèi)[6]。在植物次生代謝物中，萜類(lèi)化合物是結(jié)構(gòu)和數(shù)量種類(lèi)比例最高的化合物，目前已從植物中分離出多種萜類(lèi)化合物及其衍生物[7]。不同類(lèi)型萜類(lèi)化合物的合成和積累依賴(lài)于代謝途徑中關(guān)鍵酶的作用，這些酶通常位于合成途徑的分支點(diǎn)，催化各種前體和中間體的形成[8]。因此，可以通過(guò)對(duì)關(guān)鍵酶基因的克隆和表達(dá)來(lái)研究植物香氣的合成機(jī)理。過(guò)表達(dá)DXR基因會(huì)提高青蒿中的青蒿素的含量[9]。Veau[10]等克隆了長(zhǎng)春花DXR基因，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與單萜物質(zhì)吲哚生物堿含量變化相關(guān)。過(guò)表達(dá)DXR基因會(huì)增強(qiáng)擬南芥葉綠素等異戊二烯類(lèi)化合物的生成[11]。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了10 株轉(zhuǎn)基因煙草，轉(zhuǎn)基因煙草中DXR基因的表達(dá)水平有明顯提高。轉(zhuǎn)基因煙草中單萜化合物含量比對(duì)照植物增加了1.42倍，表明過(guò)表達(dá)薰衣草DXR基因可以提高煙草單萜化合物含量，與Veau 等的研究結(jié)果一致。因此，DXR基因過(guò)表達(dá)可以改變MEP途徑的代謝通量。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究中轉(zhuǎn)基因煙草中DXR表達(dá)量與單萜化合物含量呈正相關(guān)，這為進(jìn)一步探究DXR基因在薰衣草萜類(lèi)合成中的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為薰衣草精油產(chǎn)量與品質(zhì)提供了候選基因。