趙艷姣,卓婭·買買提烏斯?jié)M,劉金玲,王紅梅

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院綜合保健內(nèi)科二病區(qū),烏魯木齊 830000)

肥胖是由能量攝入較高或體力活動(dòng)較少等因素引起的體內(nèi)能量正平衡,是多種慢性病的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素。Yamada等[1]發(fā)現(xiàn)老年人群中心血管疾病、高脂血癥和糖尿病的患病率隨體質(zhì)量指數(shù)(body mass idex,BMI)增加而增加,且肥胖組的值相對較大。老年肥胖的并發(fā)癥較多,嚴(yán)重危害身體健康。肥胖的病因涉及多方面,包括由促炎細(xì)胞因子水平升高介導(dǎo)的低度慢性炎癥狀態(tài),與脂肪組織產(chǎn)生并釋放各種促炎和抗炎因子有關(guān),如脂肪因子瘦素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等細(xì)胞因子[2]。腫瘤壞死因子樣細(xì)胞凋亡弱誘導(dǎo)物(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)屬于腫瘤壞死因子超家族促炎細(xì)胞因子,被認(rèn)為與多種疾病相關(guān),TWEAK/成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)早期反應(yīng)蛋白14(fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14,Fn14)軸也可能參與肥胖的炎癥失衡。

TWEAK與Fn14結(jié)合可激活下游信號通路,如核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路,這些通路涉及細(xì)胞增殖和分化[3]。眾所周知,NF-κB信號通路是多種疾病炎癥的核心調(diào)節(jié)因子。雖然TWEAK/Fn14軸和NF-κB通路分別被證實(shí)在肥胖的發(fā)病中具有重要地位,但二者在肥胖發(fā)生中的相互作用尚缺乏依據(jù)。本研究通過病例-對照研究來分析TWEAK/Fn14軸及激活NF-κB通路的關(guān)鍵因子表達(dá)差異與老年人中心性肥胖的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2017年9月至2018年5月在新疆農(nóng)牧區(qū)常住居民中采用多級隨機(jī)抽樣方法進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,共2100名居民參與,其中不配合222名,數(shù)據(jù)不完整40名,最終完成調(diào)查居民1838名。其中中心性肥胖836名,無肥胖1002名,按照1∶1比例由計(jì)算機(jī)隨機(jī)生成的數(shù)字分為中心性肥胖組(n=40)和無肥胖組(n=40)。調(diào)查時(shí),由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的專職人員收集性別、年齡、身高、體質(zhì)量指數(shù)、腰圍、收縮壓、舒張壓、民族、學(xué)歷、婚育史等信息。本研究經(jīng)新疆自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)定符合醫(yī)學(xué)倫理(倫理審查號:KY2021031027),所有參與者簽署知情同意書。

中心性肥胖的診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)《中國居民肥胖防治專家共識(shí)》[4],無肥胖為男性腰圍<90cm、女性腰圍<85cm;中心性肥胖為男性腰圍≥90cm、女性腰圍≥85cm。

納入標(biāo)準(zhǔn):年齡≥60歲;能獨(dú)立行走,未使用輔具。排除標(biāo)準(zhǔn):認(rèn)知障礙;言語障礙;精神疾病;疾病急性發(fā)作期;重要器官功能衰竭;近期手術(shù)史;服用激素類藥物;感染性疾病;惡性腫瘤及肺結(jié)核等消耗性疾病。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及檢測指標(biāo) 每位研究對象采集空腹靜脈血至少5ml,放入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管中,輕輕顛倒8～10次,充分混勻;立即進(jìn)行梯度離心,分離血清與外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),血清樣本測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、肌酐(creatinine,Cr)、總膽固醇(total cholesterol,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量。將分離好的PBMC添加1ml Trizol試劑,儲(chǔ)存于-80℃冰箱,待實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測mRNA表達(dá);另外一部分PBMC直接儲(chǔ)存于-80℃冰箱,用于Western blotting檢測蛋白表達(dá)。

1.2.2 PCR檢測 采用PCR檢測PBMC中TWEAK、Fn14、IκB激酶-α(inhibitor of kappa B kinase-α,IKKα)、IκB激酶-β(inhibitor of kappa B kinase-β,IKKβ)、NF-κBp65的mRNA表達(dá)。使用primer5軟件設(shè)計(jì)TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κBp65基因引物序列,詳見表1;反應(yīng)體系包括Evagreen 2×qPCR master mix 10μl、上游引物0.6μl、下游引物0.6μl、cDNA 2μl、RNase-free water6.8μl,總反應(yīng)體積為20μl。PCR條件:預(yù)變性95℃ 10min、1個(gè)循環(huán),變性95℃ 15s,退火/延伸60℃ 60s,共40個(gè)循環(huán)。通過SYBR法進(jìn)行熒光定量檢測,采用2-△△ct的方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 熒光定量mRNA檢測引物信息

表2 中心性肥胖組及對照組臨床資料比較

1.2.3 Western blotting 采用Western blotting檢測TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)情況。將細(xì)胞樣本經(jīng)胰酶消化后,加300μl裂解液充分混勻。4℃放置1h,12000轉(zhuǎn)/min,4℃,離心15min,收集上清。80V恒壓使溴酚藍(lán)至分離膠處,恒壓100V,90min。十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳結(jié)束,將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜在甲醇中浸泡10s,蒸餾水中漂洗1min,然后將聚丙烯酰胺凝膠、濾紙及處理過的PVDF膜在Transfer buffer中浸泡10min,制備轉(zhuǎn)膜“三明治”。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜水洗3次,10min/次。用含5%脫脂奶粉封閉液封閉轉(zhuǎn)印膜1h,然后TBST洗3次,10min/次。隨后進(jìn)行一抗和二抗的孵育。將顯色液混合,加2ml至膜上,化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床特征比較

兩組間年齡、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)及性別構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、生化指標(biāo)、民族、文化程度、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、冠心病構(gòu)成差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;表3)。

2.2 兩組外周血PBMC各基因mRNA含量比較

中心性肥胖組外周血PBMC中的Fn14、IKKα、IKKβ基因mRNA含量高于對照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中心性肥胖組TWEAK及NF-κBp65基因mRNA含量也高于對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;表4)。

表4 外周血PBMC中基因mRNA表達(dá)水平分析

2.3 兩組外周血PBMC各因子的蛋白表達(dá)水平比較

與對照組相比,中心性肥胖組外周血PBMC中的Fn14、IKKα、IKKβ蛋白表達(dá)水平升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩組間TWEAK、NF-κBp65差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;表5,圖1)。

圖1 Western blotting 檢測各蛋白表達(dá)Figure 1 Protein expression band diagram TWEAK: tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis; Fn14: fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14; IKKα: inhibitor of kappa B kinase-α; IKKβ: inhibitor of kappa B kinase-β; NF-κBp65: nuclear factor-kappa-B p65.

表5 血清分離PBMC中各蛋白表達(dá)水平分析

2.4 TWEAK/Fn14及各基因間雙變量Pearson相關(guān)性分析

外周血PBMC中TWEAK與Fn14的mRNA水平呈正相關(guān)(P<0.01),與IKKα、IKKβ水平無相關(guān)性;而Fn14的mRNA水平與IKKα、IKKβ的水平均呈正相關(guān)(P<0.05);IKKα、IKKβ的mRNA水平與NF-κBp65的水平也均呈正相關(guān)(P<0.01;表6)。

表6 外周血PBMC中各基因mRNA含量相關(guān)性分析

3 討 論

肥胖會(huì)引起老年人多器官免疫系統(tǒng)的改變,使脂肪組織、肝臟、胰島等呈低度慢性炎癥[5]。實(shí)際上肥胖與脂肪組織升高有關(guān),脂肪組織生長可能是每個(gè)成熟脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)負(fù)荷增加或數(shù)量增多,亦或是兩者兼有。脂肪組織除儲(chǔ)存能量外,也是一種內(nèi)分泌細(xì)胞,會(huì)產(chǎn)生多種炎癥分子,稱為脂肪細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-6、瘦素等[6],因促炎因子升高導(dǎo)致體內(nèi)長期處于低度慢性炎癥狀態(tài)。

TWEAK是TNF超家族的Ⅱ型膜蛋白,其膜結(jié)合形式(a membrane anchored form,mTWEAK)和可溶性變體(a cleaved soluble form,sTWEAK)都有生物活性,均可結(jié)合受體Fn14,進(jìn)而控制許多生物活動(dòng)[7]。Fn14是TWEAK的特異性受體,在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與TWEAK相互作用,通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子結(jié)合位點(diǎn)與該因子家族蛋白相結(jié)合而傳導(dǎo)TWEAK信號。TWEAK在成人組織中廣泛表達(dá),如單核細(xì)胞、骨骼肌和脂肪細(xì)胞等。研究表明在肥胖者的皮下和內(nèi)臟脂肪組織中TWEAK及Fn14的水平升高[8],但也有研究表明[9]TWEAK和相應(yīng)的激動(dòng)性抗體具有防止脂肪組織生長的潛力。Ponce-de-Leon等[10]發(fā)現(xiàn)皮下或內(nèi)臟脂肪與TWEAK呈負(fù)相關(guān)。本研究提示中心性肥胖組人外周血PBMC中的Fn14基因mRNA含量及蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而中心性肥胖組TWEAK基因mRNA含量及蛋白表達(dá)水平雖高于對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fn14作為TWEAK的受體,在本研究中二者呈正相關(guān)(r=0.472,P<0.01)。Gomez-Martin等[11]在肥胖者中檢測到sTWEAK水平降低,其原因有兩種可能:一種是在炎癥因子刺激下Fn14表達(dá)增加,從而增加了sTWEAK的可用性,這可能導(dǎo)致血清sTWEAK的外周減少[12];另一種假設(shè)提出了分化簇163(cluster of diffe-rentiation 163,CD163)的參與,CD163是一種單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞表面受體,已被認(rèn)為是sTWEAK的清道夫受體?？扇苄訡D163(a soluble form CD163,sCD163)是一種巨噬細(xì)胞特異性血清標(biāo)志物,炎癥條件下升高,在體外可促進(jìn)sTWEAK降解[13]。因此,sTWEAK的減少可能與sCD163的存在有關(guān)。本研究中老年中心性肥胖組與對照組之間TWEAK表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能與sTWEAK的減少有關(guān)。

TWEAK與Fn14結(jié)合已被證明可激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路,包括NF-κB通路。NF-κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子,與增殖、分化、凋亡、炎癥等相關(guān)。活化的NF-κB可促進(jìn)大多數(shù)炎癥細(xì)胞因子分泌[14]。NF-κB作為二聚體發(fā)揮作用,在細(xì)胞中最常見形式是p50/p65和p50/p50,其次是p50/c-Rel和p52/RelB,取決于細(xì)胞類型和激活刺激物。NF-κB通路是通過IKK復(fù)合物激活的,該復(fù)合物主要由兩個(gè)催化亞基IKKα、IKKβ和一個(gè)寡聚調(diào)節(jié)亞基IκB激酶-γ(inhibitor of kappa B kinase-γ,IKKγ)組成[15]。在生理?xiàng)l件下,NF-κB位于細(xì)胞質(zhì)中,與抑制劑IκB結(jié)合而無活性。據(jù)報(bào)道IKK-β是多種促炎因子激活NF-κB通路的必要亞基。在刺激先天免疫受體(如Toll樣受體)或細(xì)胞因子受體(如Fn14受體)后,IKKβ被激活并磷酸化IκB蛋白,導(dǎo)致IκB失活后與NF-κB解離,誘導(dǎo)NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄[16],此為NF-κB經(jīng)典途徑激活。相比之下,替代途徑需激活上游NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK或MAP3K14)和IKKα,并將p100亞基蛋白水解加工成p52[17]。研究證實(shí)通過IKK抑制劑可下調(diào)脂肪組織中IKK/NF-κB通路,以減弱肥胖的慢性炎癥狀態(tài)[18]。Romo等[19]發(fā)現(xiàn)肥胖釋放的細(xì)胞外基質(zhì)可使IKKα、IKKβ的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加,并激活NF-κB通路發(fā)揮促炎作用。然而Tsaousidou等[20]證明表達(dá)刺豚鼠相關(guān)肽的神經(jīng)元中的IKK2激活不會(huì)導(dǎo)致肥胖。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,中心性肥胖組PBMC中IKKα、IKKβ基因mRNA含量及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);Fn14的mRNA水平與IKKα、IKKβ的水平均呈正相關(guān)(r=0.262、0.275;P<0.05);IKKα、IKKβ與NF-κBp65基因mRNA含量呈正相關(guān)(r=0.747、0.692;P<0.01);提示TWEAK/Fn14可能與NF-κB激活相關(guān)。考慮到NF-κB轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于不同類型的細(xì)胞中,發(fā)揮作用的二聚體類型較多,且具體取決于細(xì)胞類型和激活刺激物,故該研究NF-κBp65蛋白表達(dá)水平減低可能與脂肪細(xì)胞中的表達(dá)較其他細(xì)胞(如骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等)較低相關(guān),但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上,本研究通過探討TWEAK/Fn14及激活下游NF-κB通路的關(guān)鍵炎癥因子表達(dá)與老年中心性肥胖的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)新疆農(nóng)牧區(qū)常駐老年人中心性肥胖與外周血PBMC中Fn14、IKKα、IKKβ的蛋白、mRNA的高表達(dá)相關(guān),TWEAK/Fn14可能通過調(diào)節(jié)IKK激活NF-κB通路,參與老年中心性肥胖的進(jìn)展。但該研究為橫斷面研究,只能探究其相關(guān)性,且樣本量較少,未來需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步開展前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證,并開展細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究相關(guān)機(jī)制。