何文兵，李 明，崔艷艷，張曉燕，付安軍，黃 鶴

酚類(lèi)物質(zhì)的含量和比例不僅影響葡萄酒的顏色、收斂性、澄清度和穩(wěn)定性等的感官品質(zhì)，還決定著葡萄酒的抗氧化等生理活性功能［1?2］，其抗動(dòng)脈粥樣硬化功效越來(lái)越受到人們的重視.

酚類(lèi)物質(zhì)在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過(guò)程中的變化極其復(fù)雜［3?4］.具有山葡萄典型特點(diǎn)的北冰紅葡萄，其品質(zhì)與栽培地氣候條件、土壤條件、地形條件及修剪整形方式等因素關(guān)系密切，而氣候條件、土壤條件對(duì)葡萄品質(zhì)起著決定性的作用，進(jìn)而影響著葡萄酒中酚類(lèi)物質(zhì)（花色素和單寧）及芳香物質(zhì)（包括游離態(tài)和結(jié)合態(tài)）的含量，以及葡萄酒的品質(zhì)［5?9］.鴨綠江河谷獨(dú)特的風(fēng)土條件為北冰紅葡萄的栽培提供了保障，合適的采收期影響葡萄漿果的特殊風(fēng)味，進(jìn)而影響著葡萄酒的商業(yè)價(jià)值.

本研究以鴨綠江河谷三個(gè)采樣點(diǎn)的五個(gè)不同采收期采摘的北冰紅葡萄為原料，分析不同采收期北冰紅葡萄果實(shí)不同部位總酚含量的變化規(guī)律，旨在確定該地區(qū)環(huán)境條件下北冰紅葡萄的最適采收期，對(duì)明確當(dāng)?shù)乇北t葡萄采收的依據(jù)，不斷提升葡萄酒品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義，為北冰紅葡萄相關(guān)產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供更多理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）、糖度計(jì)、數(shù)顯游標(biāo)卡尺（哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限責(zé)任公司）、分析天平（梅特勒?托利多電子天平）.

1.1.2 主要試劑

福林酚（分析純），樂(lè)美天德思特生物；石油醚、甲醇、無(wú)水碳酸鈉、一水和沒(méi)食子酸（以上試劑均為分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液氮（99.9%），通化富氏氧氣有限公司.

1.1.3 試驗(yàn)材料

北冰紅葡萄，于2022 年采自集安市鴨江谷酒莊有限公司葡萄基地.取樣方法參考岳泰新［10］、李小龍［11］的方法，將所選擇的各葡萄山去除三排邊行后，按“S”字形隨機(jī)選擇植株采集，用冰袋低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，在?40 ℃的冰箱內(nèi)儲(chǔ)存.采樣時(shí)間見(jiàn)表1.

表1 不同取樣地及取樣時(shí)間

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基本指標(biāo)測(cè)定

（1）平均單粒果粒重量：采用分析天平進(jìn)行稱量，重復(fù)3 次.

（2）果?？v莖、果粒橫徑及果型指數(shù)：采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺對(duì)采樣后的葡萄果粒進(jìn)行縱莖和橫徑的測(cè)量，重復(fù)3 次，并依據(jù)公式計(jì)算果型指數(shù).

果型指數(shù)=果實(shí)縱徑/果實(shí)橫徑.

（3）總可溶性固形物：采用數(shù)顯折射儀測(cè)量，測(cè)定時(shí)記好讀數(shù)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示可溶性固形物的含量.重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差.

1.2.2 總酚測(cè)定

參照趙紅等［12］的方法，采用福林肖卡法，并略有調(diào)整，總酚測(cè)定結(jié)果以沒(méi)食子酸（GAE）計(jì)［13］.

（1）繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.將25.0 mg沒(méi)食子酸溶于10 mL 的60% 鹽酸甲醇溶液中，并用超純水定容至500 mL（現(xiàn)配），即為500 mg/L 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；配制不同濃度梯度的沒(méi)食子酸溶液（0 mg/L、50 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、500 mg/L）.

分別吸取不同濃度沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，使其與0.2 mL 福林酚試劑混勻靜置1 min 后，添加1 mL 的Na2CO（312%）后混合震蕩，用6.6 mL 的蒸餾水進(jìn)行定容，暗處避光反應(yīng)1 h，隨后在波長(zhǎng)765 nm 下測(cè)定吸光度，每個(gè)處理平行重復(fù)三次測(cè)定結(jié)果，以沒(méi)食子酸溶液濃度作為橫坐標(biāo)，以吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

（2）樣品預(yù)處理.葡萄皮樣品預(yù)處理：?40 ℃冷凍葡萄，立即剝?nèi)∑咸哑?，液氮冷凍粉碎成粉末裝于培養(yǎng)皿中，真空冷凍干燥24 h，取出裝于自封袋中，存放于?80 ℃冰箱中［14］.

葡萄籽樣品預(yù)處理：?40 ℃冷凍葡萄，立即剝?nèi)∑咸炎?，使用粉碎機(jī)進(jìn)行葡萄籽的破碎，葡萄籽真空冷凍干燥24 h，并用0.18 mm孔徑（80 目）篩進(jìn)行篩選，將過(guò)篩的葡萄籽粉使用石油醚進(jìn)行脫脂，其比例1∶5，脫脂48 h，脫脂結(jié)束使用真空泵進(jìn)行抽濾，抽濾結(jié)束后在鼓風(fēng)烘干箱中將葡萄籽粉烘至恒重.

稱取0.1 g 北冰紅葡萄干粉于50 mL 離心管中（離心管要用錫箔紙包裹），加入20 mL料液比1∶20 的鹽酸甲醇溶液置于超聲波提取機(jī)中（溫度為30 ℃，功率為40 W）提取1 h，然后在4 ℃、5 000 rpm 的條件下進(jìn)行離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至絲口瓶中［15］，沉淀物重復(fù)進(jìn)行2 次上述提取過(guò)程，合并3 次上清液，用超純水定容至100 mL 備用.

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，所構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.001 4x?0.001（R2=0.999 3），說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性較高.標(biāo)樣在0～500 mg/L內(nèi)有良好的線性關(guān)系，符合總酚的定量檢測(cè).

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同采收期的北冰紅葡萄基本理化指標(biāo)

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，以SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，并用Duncan顯著性差異檢驗(yàn).

由表2 可知，葡萄果實(shí)的平均單粒果粒重量隨著葡萄的成熟總體趨勢(shì)呈增長(zhǎng)狀態(tài)，且相互間均存在顯著差異（p<0.05）.整體上在T1～T2 時(shí)期迅速增長(zhǎng)，T2～T3 時(shí)期趨于平緩，但北冰紅A 坡在T2～T3 時(shí)期呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能與測(cè)量時(shí)產(chǎn)生的誤差有關(guān)，也可能受到生長(zhǎng)環(huán)境變化的影響［16］.葡萄果實(shí)成熟后期單粒果粒重差異不顯著，至T4、T5 時(shí)期，三個(gè)采樣點(diǎn)果型指數(shù)基本恒定，可能此時(shí)期果實(shí)已經(jīng)成熟，發(fā)育緩慢.

表2 不同采收期北冰紅葡萄的基本理化指標(biāo)

A 坡北冰紅葡萄果實(shí)在T5 時(shí)期總酚含量達(dá)到1.53±0.01 g，高于同一時(shí)期的B 坡和A/B坡，原因在于A 坡所處地理位置的光照強(qiáng)度和溫度高于其他坡，其外部環(huán)境條件更有利于果實(shí)的生長(zhǎng).有研究表明，若在葡萄開(kāi)花期溫度低于14 ℃會(huì)導(dǎo)致受精不好，子房大量脫落，影響果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量［17］.

葡萄果實(shí)的可溶性固形物的百分含量隨著葡萄的成熟總體呈先快后慢的增長(zhǎng)模式，且相互間均存在顯著差異（p<0.05）.T2～T3 時(shí)期上升幅度最大，表明此階段是果實(shí)向生理成熟轉(zhuǎn)變的重要時(shí)期，至T4、T5 時(shí)期，三個(gè)采樣點(diǎn)果實(shí)中可溶性固形物含量最高.而黃競(jìng)等［18］對(duì)不同采收期“野釀2 號(hào)”毛葡萄酒理化特征和芳香組成的含量研究中發(fā)現(xiàn)，隨著采收期的延長(zhǎng)，毛葡萄中的總糖增多，與該試驗(yàn)A 坡、B 坡的含量變化結(jié)果相符，但A/B 坡T5 時(shí)期的可溶性固形物含量偏低，可能受當(dāng)時(shí)采收期所處位置競(jìng)爭(zhēng)性雜草和濕度狀況的影響.

可溶性固形物含量的增加主要是葡萄植株其他部分所積累的物質(zhì)向果實(shí)運(yùn)輸而導(dǎo)致的［19］.大部分中晚熟葡萄品種，因生長(zhǎng)期較長(zhǎng)和糖分的長(zhǎng)時(shí)間積累，所以到采摘末期含糖量相對(duì)較高［20］，而葡萄在發(fā)育的不同時(shí)期（花芽分化、開(kāi)花過(guò)程和果實(shí)發(fā)育及轉(zhuǎn)色后期），其酚類(lèi)物質(zhì)的累積及含糖量的增長(zhǎng)等生命過(guò)程，又與氣溫密切相關(guān)，高溫對(duì)含糖量的提高和含酸量的減少都有促進(jìn)作用［21］，同時(shí)高溫也引起了水果中有機(jī)酸和可溶性固形物濃度的減少.

北冰紅葡萄是釀制冰酒的重要原料，葡萄果實(shí)的糖含量積累變化規(guī)律的研究尤為關(guān)鍵［22］，其糖分水平與葡萄的采收期和成熟度有著直接關(guān)系，影響葡萄酒質(zhì)量.

葡萄果實(shí)的大小及內(nèi)含物對(duì)其在收獲期間的質(zhì)量有重要影響.北冰紅葡萄T1?T2 果粒的生長(zhǎng)速度很快，果實(shí)橫縱徑增長(zhǎng)較為明顯.在此過(guò)程中，不僅果粒的大小發(fā)生變化，果實(shí)也發(fā)生著從綠到紫的變化［23］.本試驗(yàn)研究北冰紅釀酒葡萄果實(shí)在生長(zhǎng)期各品質(zhì)的變化與張穩(wěn)穩(wěn)［24］所研究的“北紅”和“北玫”生長(zhǎng)過(guò)程中的質(zhì)量指標(biāo)的變化規(guī)律是一致的.

由表2 可知，果形指數(shù)大約在0.99～1.05 之間，表明北冰紅葡萄屬于圓型果實(shí).果形指數(shù)隨果實(shí)不斷成熟，變化趨勢(shì)不明顯，且北冰紅A 坡和北冰紅B 坡不同時(shí)期的果形指數(shù)不存在顯著性差異，所以本研究中果形指數(shù)不作為最適采收期的參考標(biāo)準(zhǔn).

2.3 不同采收期北冰紅葡萄果實(shí)不同部位總酚含量變化趨勢(shì)

測(cè)試了不同時(shí)期、同一采收地不同坡度北冰紅葡萄（皮和籽）的總酚，北冰紅A 坡、B坡和A/B 坡.測(cè)定結(jié)果如圖2 所示.

圖2 不同采收期北冰紅葡萄中總酚含量變化趨勢(shì)

由圖2 可知，整體看來(lái)，隨著采收期的延長(zhǎng)總酚含量逐漸升高，且存在顯著差異（p<0.05）.其中圖2（a）從生長(zhǎng)階段到成熟階段，總酚含量的累積趨勢(shì)是：下降?上升?下降?上升.圖2（b）總酚含量積累趨勢(shì)呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì).圖2（c）總酚含量積累趨勢(shì)呈先下降后上升的趨勢(shì).其中圖2（a）在T3 采收期總酚高于同一時(shí)期的其他坡，可能是由于A 坡的光照時(shí)長(zhǎng)高于其他坡，光照是植物生命活動(dòng)中的重要的生態(tài)作用因素，影響著葡萄漿果成熟過(guò)程中物質(zhì)的積累.而B(niǎo) 坡在T3 時(shí)期的采收環(huán)境條件未能達(dá)到葡萄生長(zhǎng)的最適條件，至T5 時(shí)期總酚累積含量才達(dá)到最高.圖2（a）與圖2（b）的對(duì)比表明日照時(shí)間對(duì)果實(shí)的大小、顏色和內(nèi)含物質(zhì)的形成都有很大的影響，且總酚含量隨采收期的延長(zhǎng)而增高，這可能是因?yàn)樵诔墒旌?，合成總酚的關(guān)鍵酶及調(diào)節(jié)因子的活性會(huì)有所提高，這對(duì)總酚的合成與積累有利［25］，也可能與當(dāng)?shù)氐臍夂蛞蛩氐茸匀粭l件有關(guān)，同時(shí)也受其自身品種屬性的影響［26］.但不同坡度T5 時(shí)期的北冰紅葡萄果實(shí)（皮和籽）中總酚含量均達(dá)到最高，分別為88.48±4.76 mg/g、88.06±8.35 mg/g、78.34±3.67 mg/g，高于其他時(shí)期的總酚含量.

圖2（a）、圖2（b）、圖2（c）果籽中總酚含量的變化均呈先下降后上升的趨勢(shì).表明成熟末期葡萄皮中的總酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于果籽中的總酚含量.圖2（a）果皮中總酚含量與果皮+果籽中總酚含量變化趨勢(shì)一致.由此可見(jiàn)葡萄果皮總酚物質(zhì)的含量與該葡萄品種的成熟度和最佳采收期有關(guān).其中A 坡果皮在T3 時(shí)期和T5 時(shí)期總酚含量分別為57.64±9.17 mg/g和52.98±4.80 mg/g，而B(niǎo) 坡和A/B 坡在T5 時(shí)期最高總酚含量分別為65.64±9.44 mg/g、52.87±5.64 mg/g，可能由于A 坡的日照時(shí)長(zhǎng)和溫度高于B 坡和A/B 坡，導(dǎo)致A 坡北冰紅葡萄在T3時(shí)期已成熟達(dá)到采收的標(biāo)準(zhǔn)，而B(niǎo) 坡和A/B 坡的葡萄還處于生長(zhǎng)發(fā)育的階段，由于溫度和日照時(shí)長(zhǎng)低于A 坡，所以生長(zhǎng)周期比A 坡長(zhǎng)，到T5 時(shí)期才開(kāi)始成熟，達(dá)到采收的標(biāo)準(zhǔn).

3 結(jié)語(yǔ)

酚類(lèi)物質(zhì)是葡萄漿果中重要的次生代謝產(chǎn)物，作為葡萄酒的“骨架成分”，影響葡萄酒的色澤、風(fēng)味和口感上的收斂性，是國(guó)內(nèi)外葡萄與葡萄酒研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn).本文以福林肖卡法測(cè)定鴨綠江河谷產(chǎn)區(qū)3 個(gè)采樣點(diǎn)的不同采收期北冰紅葡萄漿果的常規(guī)指標(biāo)及果皮、果籽中的總酚含量，探究時(shí)間和空間與北冰紅葡萄漿果中不同部位總酚含量變化規(guī)律，并結(jié)合其果實(shí)品質(zhì)，評(píng)估栽培地點(diǎn)及取樣時(shí)間對(duì)釀酒葡萄的品質(zhì)的影響，為葡萄的進(jìn)一步加工及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù).

研究結(jié)果表明：整體上果皮中總酚含量大于果籽中總酚含量，但不同采收期果皮與果籽中總酚含量大小不同，前期出現(xiàn)果籽中總酚含量大于果皮中總酚含量的情況，隨著采收期的延長(zhǎng)，果皮中總酚含量遠(yuǎn)大于果籽的總酚含量；采收期影響果實(shí)品質(zhì)，延遲采收期明顯提高了北冰紅葡萄大小、平均單果重和可溶性固形物含量；采收期影響果實(shí)總酚含量，不同采收期北冰紅葡萄中總酚的含量有較大差別，且同一階段的北冰紅葡萄，其果肉和果籽中的總酚含量也有較大差別，T5 時(shí)期的北冰紅葡萄總酚含量較高.

因此，在鴨綠江河谷地區(qū)，適當(dāng)延長(zhǎng)收獲時(shí)間能明顯增加北冰紅葡萄的總酚及可溶性固形物的含量；達(dá)到提高酒質(zhì)量的目的.從而確定北冰紅葡萄的最佳收獲時(shí)期為T(mén)5.

本文僅對(duì)不同采收期的北冰紅葡萄漿果中總酚進(jìn)行了研究，后續(xù)將開(kāi)展對(duì)不同采收期的北冰紅葡萄漿果中酚類(lèi)化合物種類(lèi)及組成比例特征及其與抗氧化、抗癌及抗病毒等生理活性間的關(guān)系的研究，以期為北冰紅葡萄酒的品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)保健等方面的鑒定提供科學(xué)依據(jù).