苗得慶，周 樊，范志梁，顧春松*

膿毒癥是機(jī)體因細(xì)菌、病毒等病原微生物感染后出現(xiàn)的全身炎性反應(yīng)綜合征.該病早期識(shí)別和診斷困難，其中因診治不當(dāng)導(dǎo)致的感染性休克死亡率高達(dá)40%，嚴(yán)重危害人們健康［1］.刺梨為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的果實(shí)（RosaroxburghiiTratt），首次記載于《本草綱目拾遺》，是貴州常用的民族中藥材，其味甘、酸，是滋補(bǔ)健身的佳果.現(xiàn)代藥理研究表明，刺梨具有降血脂、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用［2］.刺梨資源豐富、價(jià)格低廉、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，是治療膿毒癥的潛在藥物.但是目前尚缺少刺梨治療膿毒癥的相關(guān)藥理作用及物質(zhì)基礎(chǔ)的具體研究，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選刺梨化學(xué)活性物質(zhì)并推測(cè)其干預(yù)膿毒癥的作用靶點(diǎn)、機(jī)制，為后期該藥物臨床應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 刺梨相關(guān)成分及靶點(diǎn)篩選

通過(guò)查閱刺梨相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其所含化學(xué)成分進(jìn)行總結(jié)，并使用chemdraw 軟件繪制各化合物結(jié)構(gòu).將繪制的各化合物結(jié)構(gòu)輸入SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)，并規(guī)定選取化合物標(biāo)準(zhǔn)：GIabsortion為“High”，說(shuō)明該成分口服生物利用度好，易吸收；Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 五 種類(lèi)藥性檢測(cè)中結(jié)果有不少于2 個(gè)“Yes”.

根據(jù)文獻(xiàn)查閱結(jié)果，若化合物藥理作用與膿毒癥相關(guān)性較高，仍保留并納入得到最終潛在化合物.再利用基于藥效團(tuán)匹配法的PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取不同潛在化合物的核心作用靶點(diǎn)，選NF（Normalized Fit Score）≥0.9的靶點(diǎn)蛋白，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，綜合得到活性化合物的核心作用靶點(diǎn).

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

為保證目標(biāo)數(shù)據(jù)正確、全面，以“sepsis”“sepsis shock”等相關(guān)膿毒癥名詞為關(guān)鍵搜索詞，搜索Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)、DRUG BANK 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得膿毒癥疾病的核心靶點(diǎn).其中DRUG BANK 數(shù)據(jù)庫(kù)由臨床試藥數(shù)據(jù)構(gòu)建，Gene Cards、OMIM、Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫(kù)基于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，故本實(shí)驗(yàn)采用不同數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行疾病靶點(diǎn)收集可獲得更加全面的靶點(diǎn)信息.將所收集靶點(diǎn)信息去重合并，使用UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將疾病靶點(diǎn)與藥物化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)統(tǒng)一規(guī)范為Gene Symbol，其后將兩者進(jìn)行映射，以獲得刺梨潛在干預(yù)膿毒癥的靶點(diǎn).

1.3 刺梨成分-膿毒癥靶點(diǎn)

將所獲的交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)，并將Organisms 選擇為“Homo sapiens”，設(shè)置置信度為0.40，隨后進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析，并將所得結(jié)果導(dǎo)入CytoScape 3.7.2 軟件.利用該軟件分析蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，得到相關(guān)蛋白質(zhì)具有的潛在功能.

1.4 刺梨成分與膿毒癥靶點(diǎn)GO 功能富集和KEGG 通路富集

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核心靶點(diǎn)的生物信息富集分析，包括GO 分析的生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）和KEGG通路.

1.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

綜合“1.4”所得生物信息富集分析結(jié)果與“1.2”所得藥物疾病交集靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入到CytoScape3.7.2 軟件中構(gòu)建：藥物成分?靶點(diǎn)?通路網(wǎng)絡(luò)圖.利用CytoScape 3.7.2 軟件得到刺梨潛在化學(xué)成分及靶點(diǎn)的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，包括介度（Betweenness）、連接度（Degree），并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果得到核心靶點(diǎn)及干預(yù)膿毒癥的主要活性成分.

1.6 分子對(duì)接評(píng)估

選擇分析得到刺梨成分?膿毒癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前6 的靶點(diǎn).通過(guò)RCSB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載其pdb 格式，利用Open Babel 軟件將核心化合物轉(zhuǎn)換為pdb 格式.采用pymol 軟件對(duì)蛋白進(jìn)行除水、去配體、加氫等處理并儲(chǔ)存為pdbqt 格式，對(duì)潛在化合物進(jìn)行減少能量并賦予配體原子類(lèi)型等處理并儲(chǔ)存為pdbqt 格式，利用Schr?dinger 軟件進(jìn)行分子對(duì)接處理，以對(duì)接得分作為判斷二者結(jié)合活性的參考.

2 結(jié)果

2.1 刺梨主要活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

綜合相關(guān)文獻(xiàn)共獲得刺梨相關(guān)的100 個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)，其主要成分為黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)，還包括萜類(lèi)等成分.通過(guò)SwissADME篩選出57 種活性成分，其中活性最強(qiáng)的10 個(gè)活性成分結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1.利用PharmMapper 預(yù)測(cè)并選擇NF≥0.9 的靶點(diǎn)，去除所有重復(fù)基因后共計(jì)132 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn).

表1 刺梨活性最高的10 種成分

2.2 刺梨干預(yù)膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)獲取

在Gene cards 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到膿毒癥疾病相關(guān)靶點(diǎn)2 974 個(gè)，選取Score≥0.55 的結(jié)果并結(jié)合Therapeutic Target Database、DRUG BANK、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充，去重合并收集到1 497個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn).將刺梨有效成分的132 個(gè)靶點(diǎn)與1 497 個(gè)膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得30個(gè)交集靶點(diǎn)，并將結(jié)果繪制成VENN 圖（圖1）.

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)VENN 圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將30 個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 分析.并利用CytoScape 3.7.2 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)信息，推測(cè)AKT、SRC、MMP9 等為核心靶點(diǎn).

圖2 刺梨-膿毒癥靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 功能富集和KEGG 通路富集

運(yùn)用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息富集分析（圖3）.圖3（a）表明刺梨干預(yù)膿毒癥相關(guān)核心生物過(guò)程為：調(diào)節(jié)脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding）、調(diào)節(jié)激酶活性（kinase activity）、調(diào)節(jié)磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（phosphotrans?ferase activity）.圖3（b）為KEGG 通路富集分析結(jié)果中刺梨干預(yù)膿毒癥排名前20 的信號(hào)通路.

圖3 刺梨主要成分潛在靶點(diǎn)的富集分析

2.5 刺梨成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用CytoScape 3.7.2 構(gòu)建“刺梨成分?靶點(diǎn)?通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并分析得到刺梨干預(yù)膿毒癥疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫畔?shù)據(jù)，進(jìn)而分析得到核心化學(xué)成分及作用靶點(diǎn).如圖4 所示，此網(wǎng)絡(luò)由167 個(gè)節(jié)點(diǎn)和361 條邊構(gòu)成，橙色節(jié)點(diǎn)表示刺梨潛在靶點(diǎn)，紅色節(jié)點(diǎn)表示刺梨中的潛在信號(hào)通路，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示刺梨活性成分.

圖4 刺梨干預(yù)膿毒癥成分-靶點(diǎn)-通路圖

通過(guò)CytoScape 對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，刺梨每種活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)連接多種成分，體現(xiàn)了刺梨內(nèi)含的多種成分可能通過(guò)多靶點(diǎn)干預(yù)膿毒癥.其中CL49（槲皮素）連接度為68，介度為0.519 333 77，緊密度為0.521 126 76，預(yù)測(cè)CL49 為刺梨干預(yù)膿毒癥的主要成分，其次為CL46（鞣花酸），連接度為41，介度為0.260 542 11，緊密度為0.440 476 19（表2）.AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9 靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度排位靠前，連接度分別為21、19、12、12，預(yù)測(cè)Phospholipase D signaling pathway 為刺梨干預(yù)膿毒癥的核心靶點(diǎn)（表3）.

表2 刺梨主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表3 刺梨主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

由表4 可知，不同通路是通過(guò)共有靶點(diǎn)相互連接形成，表明刺梨可能通過(guò)多條通路協(xié)同發(fā)力起到干預(yù)膿毒癥的作用.

表4 刺梨干預(yù)膿毒癥靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

2.6 刺梨分子對(duì)接篩選

將刺梨中排名前十名的化合物與AKT1、APOE、ERBB2、ESR1、MMP9、SRC 6 個(gè)核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，得到60 組化合物?蛋白對(duì)接結(jié)果.其中所有對(duì)接得分均

圖5 分子對(duì)接結(jié)果

圖6 刺梨部分核心化合物分子對(duì)接模式

3 討論

中醫(yī)原理中并沒(méi)有膿毒癥相關(guān)概述，根據(jù)《傷寒論》和《溫病學(xué)》的有關(guān)中醫(yī)理論，將膿毒癥歸屬于“熱病”“溫病”等范疇，多是從“毒瘀虛”闡述膿毒癥的病因病機(jī)，治療上多用清熱解毒類(lèi)藥物［3?4］.刺梨是貴州省代表民族藥物，有健脾養(yǎng)胃、補(bǔ)腎壯陽(yáng)等功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其還有提高免疫力、延緩衰老、保護(hù)血管等作用.本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建成分?靶點(diǎn)?信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)分析相關(guān)網(wǎng)絡(luò)要素（節(jié)點(diǎn)、度值等），探討了刺梨干預(yù)膿毒癥的主要成分.

3.1 成分分析

通過(guò)對(duì)刺梨成分的研究發(fā)現(xiàn)，刺梨主要活性成分以槲皮素、山奈酚、木犀草素、兒茶素等黃酮類(lèi)成分為主，而黃酮類(lèi)化合物也是刺梨果實(shí)中含量最高、活性最強(qiáng)的成分［5］.有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)PI3K 途徑減輕膿毒癥小鼠心肌組織炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到緩解心肌損傷的作用［6］.此外，槲皮素還對(duì)膿毒癥肺損傷的大鼠有保護(hù)作用，其機(jī)制與減少NF?κB p65 蛋白表達(dá)有關(guān)［7］.鞣花酸和木犀草素在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋蟹謩e排名2、3位，其中鞣花酸可通過(guò)Nrf2/HO?1 途徑對(duì)膿毒癥心功能不全的小鼠有顯著保護(hù)作用［8］，而木犀草素可通過(guò)ROS、NF?κB、Caspase 等通路發(fā)揮對(duì)膿毒癥的調(diào)控作用［9?11］.兒茶素和沒(méi)食子酸亦為刺梨的主要活性物質(zhì)，前者單獨(dú)使用可抑制NLRP3 炎癥小體活化，二者聯(lián)合使用有較強(qiáng)的抗菌活性，具有潛在的膿毒癥干預(yù)作用［12］.

分子對(duì)接結(jié)果顯示，刺梨排名前十的化合物均與主要蛋白靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合活性，且CL76（兒茶素）化合物與6 個(gè)蛋白的結(jié)合能均

3.2 潛在靶點(diǎn)分析

分析結(jié)果顯示，AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9、ERBB2、MMP2 等靶點(diǎn)排名靠前，推測(cè)可能是刺梨干預(yù)膿毒癥的關(guān)鍵靶點(diǎn).

絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）是關(guān)鍵致癌蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞存活、增殖、凋亡等過(guò)程［13］.AKT1 作為AKT 家族的重要成員，是其中最活躍的增殖和生存途徑蛋白，當(dāng)AKT 被磷酸化激活后，其下GSK3β 蛋白活性受到抑制的同時(shí)，β?catenin 的磷酸化過(guò)程被阻斷而不能降解，以至于β?catenin 在細(xì)胞內(nèi)大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，加速細(xì)胞凋亡及炎性激活［14］.因此抑制AKT1 激活有助于增加組織抗炎、抗凋亡等作用，進(jìn)而減輕腦水腫、保護(hù)血腦屏障并減輕腦損傷［15］.PI3K 是經(jīng)典存活通路蛋白，位于AKT 上游，與AKT 共同組成信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬發(fā)生，這與KEGG 分析結(jié)果一致，說(shuō)明PI3K 和AKT 靶點(diǎn)在刺激干預(yù)膿毒癥過(guò)程中起關(guān)鍵作用［16］.SRC 是酪氨酸激酶價(jià)值的重要蛋白酶，在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞募集和機(jī)體防御中具有重要作用，其可參與ROCK、NF?κB 等炎性通路過(guò)程，且有研究表明，ROCK 和NF?κB可減少膿毒癥模型中細(xì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移及肺水腫表征，減少炎性因子表達(dá)，進(jìn)而緩解膿毒癥引起的肺組織病變［17?18］.基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族蛋白在細(xì)胞凋亡中擔(dān)任重要角色，其可通過(guò)多種途徑分解細(xì)胞外基質(zhì)，其中MMP?9 和MMP?2 是最有代表性的關(guān)鍵靶點(diǎn)［19］.研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者體內(nèi)MMP?9、MMP?2 表達(dá)顯著提高，這一表現(xiàn)直接提示患者預(yù)后不佳并增加器官衰竭的幾率［20］.

3.3 通路分析

通過(guò)GO 功能富集分析可知，刺梨干預(yù)膿毒癥的生物學(xué)進(jìn)程有regulation of kinase activ?ity、protein tyrosine kinase activity、apical part of cell 等，通過(guò)KEGG 富集分析可知，刺梨干預(yù)膿毒癥的信號(hào)通路主要與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)，例如：Phospholipase D signaling pathway 和Endocrine resistance pathway.

Phospholipase D signaling pathway 是存在細(xì)胞內(nèi)的一種關(guān)鍵的次級(jí)信號(hào)傳遞系統(tǒng)，包括催化磷脂酰膽堿水解過(guò)程，是機(jī)體內(nèi)PI3K/AKT、MAPK/ERK 及PKC 等信號(hào)通路的重要活性底物.Endocrine resistance pathway 是機(jī)體內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的重要通路，其下游包括PI3K/AKT、MAPK 及Apoptosis 等關(guān)鍵通路，與Phospholi?pase D signaling pathway 有較強(qiáng)的相關(guān)性.研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 通路是生物體重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是目前唯一明確的自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路［21］，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬減輕膿毒癥引起的多器官功能障礙綜合征［22］.自噬和膿毒癥關(guān)系密切，在膿毒癥的早期便存在細(xì)胞自噬，并且表現(xiàn)為短暫的活性升高趨勢(shì)，但隨著早期高動(dòng)力狀態(tài)下消耗大量的自噬前體，在膿毒癥后期表現(xiàn)為噬障礙，自噬的清除保護(hù)作用失效，導(dǎo)致膿毒癥晚期出現(xiàn)免疫麻痹的現(xiàn)象［23］.此外，多數(shù)研究也通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)［24］，其中包括了槲皮素對(duì)PI3K/AKT通路的調(diào)節(jié)作用，這與刺梨干預(yù)膿毒癥的成分分析結(jié)果一致.MAPK 是與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及炎癥等通路的關(guān)鍵交點(diǎn)，其以磷酸化為特征激活，參與細(xì)胞調(diào)節(jié)功能［25］.MAPK 信號(hào)通路可調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥及細(xì)胞凋亡等生物過(guò)程來(lái)調(diào)控膿毒癥病情進(jìn)展，在膿毒癥動(dòng)物模型體內(nèi)的MAPK 通路相關(guān)蛋白活性顯著增強(qiáng)，因此，抑制MAPK 信號(hào)通路的活性也是干預(yù)膿毒癥的重要手段［26］.

綜上所述，膿毒癥疾病相關(guān)生物信息通路主要與Phospholipase D signaling pathway 和Endocrine resistance pathway 相關(guān)，刺梨可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT、MAPK 等信號(hào)通路干預(yù)膿毒癥.

4 結(jié)語(yǔ)

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接相關(guān)技術(shù)方法，通過(guò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，初步闡明刺梨多成分、多靶點(diǎn)共同調(diào)控膿毒癥的作用機(jī)制.刺梨可能是通過(guò)槲皮素、鞣花酸、木犀草素等活性有效成分，作用于AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9 等生物靶點(diǎn)，參與PI3K/AKT、MAPK等多條信號(hào)通路的調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮治療膿毒癥的作用.本研究基于科學(xué)理論推測(cè)刺梨干預(yù)膿毒癥的作用機(jī)制，為刺梨新藥效的發(fā)現(xiàn)提供理論參考依據(jù)，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究仍存在一定的局限性，后續(xù)研究團(tuán)隊(duì)將持續(xù)關(guān)注刺梨藥理研究進(jìn)展，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入探討刺梨干預(yù)膿毒癥的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治膿毒癥提供更有效的治療指南.