相 麗 王會(huì)月 王 緒 張榮善

1 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇省揚(yáng)州市 225009; 2 寶應(yīng)縣婦幼保健院; 3 寶應(yīng)縣人民醫(yī)院

宮頸癌(Cervical cancer,CC)是發(fā)展中國(guó)家婦女最常見的癌癥之一,在全球癌癥中宮頸癌發(fā)病率排名第三[1],目前其發(fā)病機(jī)制還未闡明。微小RNA(miRNA)是一種包含21～23個(gè)核苷酸的單鏈RNA,其主要功能是抑制編碼RNA轉(zhuǎn)錄后翻譯來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)或誘導(dǎo)靶信使RNA的降解[2]。在癌癥中miRNAs可作為癌基因和(或)抑癌基因發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[3]。雖然文獻(xiàn)報(bào)道宮頸癌組織中有一些微小RNA表達(dá)水平異常[4],但miR-4534在宮頸癌中的研究還知之甚少。本文就miR-4534在宮頸癌中的表達(dá)水平、臨床病理意義及對(duì)增殖的影響進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 樣本和資料 選取2021年1月—2022年12月期間在揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院和寶應(yīng)縣婦幼保健院接受宮頸癌根治術(shù)并確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)的71例患者作為研究對(duì)象,年齡38～66歲,中位年齡50歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床資料、病理資料無(wú)缺失者;(2)術(shù)前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者;(3)對(duì)本研究知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他部位惡性腫瘤者;(2)自身免疫性疾病、感染性疾病患者。臨床標(biāo)本使用及病理資料收集均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并與患者簽署知情同意書。

1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞 miR-4534 mimic和si-miR-4534質(zhì)粒合成于南京金斯瑞生物科技公司。宮頸癌細(xì)胞株C33A細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。通過Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-4534 mimic和si-miR-4534質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至C33A細(xì)胞株,并將細(xì)胞株均放置含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,然后放置在37℃,含有5% CO2濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培育。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) CSCC組織總RNA的抽提是通過TRIZOL試劑裂解萃取并通過分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。然后通過Prime ScriptTMⅡ1st Strand合成cDNA試劑盒(Takara公司)合成cDNA 。實(shí)時(shí)熒光定量PCR運(yùn)用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(Takara公司)并按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。miR-4534的上游引物為GACUUGUGAAUGACCCCCUU,下游引物為AUUAAGUACCCAAGACCCCU。將包含反應(yīng)體系的檢測(cè)樣本在Applied Biosystems 7500 R-T PCR system進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)步驟包括:(1)預(yù)變性:95℃,時(shí)間為30s。(2)PCR反應(yīng):重復(fù):40個(gè)循環(huán),95℃,時(shí)間為5s; 60℃,時(shí)間為45s。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 主要步驟:接種C33A細(xì)胞懸液100μl 于96孔板,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。取出C33A細(xì)胞培養(yǎng)瓶,加入10μl體積的CCK-8,充分混合。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3h。置于孔板于搖床振蕩約1min,用酶標(biāo)儀讀取450nm光吸收值(注意在結(jié)果中需要減去具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光值),計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn) 組織切片厚度4μm,脫蠟至水洗。用H2O2滅活組織切片內(nèi)源性的過氧化物酶。使用抗原修復(fù)液修復(fù)抗原。使用羊血清封閉液封閉。去除封閉液后滴加即用型Ki-67一抗, 4℃冰箱過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗,37℃培養(yǎng)箱中孵育1h;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液,37℃孵育30min;DAB染色液顯色,蘇木素復(fù)藍(lán),透明,封片,光鏡下觀察。陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒。用PBS緩沖液代替一抗作空性對(duì)照。

1.6 裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn) BALB/C-nu/nu裸鼠來(lái)源于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,裸鼠重量23～27g,5～7周齡,分為實(shí)驗(yàn)組20只和對(duì)照組20只,飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物培養(yǎng)箱里。在第4天于裸鼠右側(cè)腋腹壁的皮下接種C33A細(xì)胞100μl,約5×106個(gè)細(xì)胞。接種后每天監(jiān)測(cè)裸鼠及皮下瘤組織生活和生長(zhǎng)情況。50d后拉頸迅速處死裸鼠,完整剝離瘤體, 對(duì)腫瘤體積大小和重量進(jìn)行測(cè)量,并給予拍照。移植瘤做相關(guān)實(shí)驗(yàn)。裸鼠研究獲得揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS16.0和Graph Pad 5.0軟件分析數(shù)據(jù)和編輯圖片。計(jì)數(shù)資料組間采用Pearson’s法χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,符合正態(tài)分布,兩組間t檢驗(yàn),多組間ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSCC組織中miR-4534的表達(dá) 通過微小RNA表達(dá)譜并設(shè)置相關(guān)條件:miRNA表達(dá)水平上調(diào)、FC≥1.5且P<0.01,因而得到5個(gè)表達(dá)水平上調(diào)的miRNA:miR-548ac、miR-4534 (FC = 2.47,P= 0.001)、miR-483-5p、miR-564和miR-92b-5p。然后將這5個(gè)miRNA在71對(duì)CSCC組織中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖1所示,僅有miR-4534和miR-92b-5p表達(dá)水平升高(t=10.456、6.417,P<0.05)。本文選擇表達(dá)水平更高的miR-4534作為研究對(duì)象。

圖1 qRT-PCR 驗(yàn)證差異性表達(dá)的miRNAs

2.2 miRNA-4534的表達(dá)及臨床病理意義 根據(jù)miR-4534的表達(dá)水平,探討其與臨床病理資料的相關(guān)性。根據(jù)表達(dá)水平的高低,將表達(dá)水平高于對(duì)照組的50例為高表達(dá)組;其余21例為正常表達(dá)(與對(duì)照組表達(dá)近似)+低表達(dá)組(表達(dá)水平低于對(duì)照組)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示,miRNA-4534的表達(dá)與腫瘤直徑和分化程度密切相關(guān)(均P<0.05),而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。這一結(jié)果提示miR-4534參與了CSCC的生長(zhǎng)增殖過程。

表1 兩組臨床病理特征比較

2.3 miRNA-4534對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖活性的影響 2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-4534與腫瘤直徑相關(guān),因此本文進(jìn)一步通過CCK-8實(shí)驗(yàn)研究miR-4534對(duì)CSCC細(xì)胞增殖活性的影響。如圖2所示,在72h時(shí),與過表達(dá)對(duì)照組(0.67±0.05)相比,過表達(dá)miR-4534 (0.92±0.04)促進(jìn)了C33A細(xì)胞的增殖活性;與減低表達(dá)對(duì)照組(0.70±0.06)相比,降低miR-4534表達(dá)(0.48±0.03)則抑制了C33A細(xì)胞的增殖活性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

圖2 CCK-8增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 裸鼠實(shí)驗(yàn)降低miRNA-4534表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 已知在CSCC中miR-4534表達(dá)水平上調(diào),故在體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)中僅驗(yàn)證降低miR-4534表達(dá)后對(duì)宮頸癌生長(zhǎng)的影響。BALB/C裸鼠實(shí)驗(yàn)分為兩組,即降低miR-4534表達(dá)組(si-miR-4534表達(dá)組,20只,5周)和對(duì)照組(20只,5周);每只裸鼠在右側(cè)腋腹壁的皮下接種C33A細(xì)胞 2×106個(gè)/100μl。每天監(jiān)測(cè)并制作出移植瘤生長(zhǎng)曲線。50d后,拉頸處死裸鼠,取出移植瘤并測(cè)量體積和大小,拍照,然后對(duì)組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:降低miR-4534表達(dá)后移植瘤生長(zhǎng)體積和重量均明顯小于對(duì)照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 裸鼠實(shí)驗(yàn)中移植瘤的生長(zhǎng)體積和重量

另外, Ki-67染色顯示降低miR-4534組的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例為(28.3±3.1)%,明顯低于對(duì)照組(76.2±6.4)%的陽(yáng)性比例(P<0.05),見圖4。

圖4 Ki-67染色結(jié)果

3 討論

近年來(lái)研究表明miRNA中既有促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的miRNAs,又有抑制宮頸癌進(jìn)展的miRNAs。例如,miR-139-3p能通過負(fù)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞中的NOB1來(lái)抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。miR-424通過上調(diào)靶基因Chk1的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌癥的進(jìn)展。miR-424可能成為預(yù)測(cè)癌癥患者預(yù)后的潛在指標(biāo)和候選靶向治療[5]。上調(diào)的miR-93能下調(diào)CDKN1A表達(dá),能使患者生存率最短[6]。宮頸癌中miR-92a直接靶向p21發(fā)揮致癌作用,從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展[7]。miR-1297的低表達(dá)水平與癌癥分化不良和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[8];miR-195的表達(dá)降低與癌癥患者的晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[9];miR-218與宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲、誘導(dǎo)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲相關(guān)[10]。

miR-4534定位于基因位點(diǎn)chr22: 37988794-37988853[+](GRCh38;GCA_000001405.15),其成熟基因序列為GGAUGGAGGAGGGGUCU。通過miRNA表達(dá)譜分析研究表明[11]在宮頸癌中miR-4534、miR-483-5p、miR-92b-5p和miR-548ac均表達(dá)水平升高,但對(duì)于miR-4534在宮頸癌中的作用研究并未深入探討。而miR-4534在前列腺癌中過度表達(dá),促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移/侵襲[12]。因此本文研究miRNA-4534在宮頸癌中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn),在71例CSCC組織中miRNA-4534表達(dá)水平升高,說(shuō)明miRNA-4534發(fā)揮著促癌基因的作用。進(jìn)一步分析miRNA-4534表達(dá)與CSCC臨床病理意義時(shí)發(fā)現(xiàn),miR-4534表達(dá)與腫瘤大小和分化程度密切相關(guān),而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期之間無(wú)相關(guān)性;表明miRNA-4534在CSCC中miR-4534表達(dá)水平越高,癌細(xì)胞分化程度越低,就越能生長(zhǎng),進(jìn)一步說(shuō)明miR-4534是一個(gè)促癌基因,可成為CSCC增殖的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步行功能研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-4534后,細(xì)胞的增殖活性升高;降低miR-4534表達(dá)后,細(xì)胞的增殖活性下降,再次提示miR-4534參與了CSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)過程。在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中,敲低miR-4534表達(dá)后移植瘤生長(zhǎng)緩慢,體積較小,瘤體重量也較輕。Ki-67染色發(fā)現(xiàn),敲低組中Ki-67陽(yáng)性比例明顯低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA-4534能促進(jìn)CSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。

綜上所述,miR-4534在CSCC中表達(dá)水平上調(diào),與腫瘤的分化程度和直徑大小密切相關(guān);miR-4534促進(jìn)CSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,發(fā)揮促癌基因的作用。本研究探討了miRNA-4534在CSCC生長(zhǎng)過程中的作用,為今后診斷和治療CSCC提供新的思路。