孫業(yè)香 王瀟瀟 王麗華 呂常旭

煙臺(tái)南山學(xué)院,山東省龍口市 265713

膀胱癌是臨床最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,也是全球最普遍的癌癥之一[1]。據(jù)全球癌癥負(fù)擔(dān)統(tǒng)計(jì),全世界每年診斷超過(guò)18萬(wàn)新發(fā)癌癥病例,其中3.0%的新發(fā)癌癥診斷和2.1%的癌癥死亡是由膀胱癌引起的,且隨著世界人口結(jié)構(gòu)的變化及各種不同風(fēng)險(xiǎn)因素的變化,其發(fā)病率和死亡率也隨之變化[2]。膀胱癌具有多發(fā)性、多器官和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),即使經(jīng)規(guī)范化治療,仍有較高的復(fù)發(fā)率,且本病的病因復(fù)雜,涉及基因、蛋白、代謝等因素對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、凋亡等生命活動(dòng)的影響[3]。近年來(lái),越來(lái)越多的學(xué)者從影響癌細(xì)胞生命活動(dòng)方面進(jìn)行研究,以期為膀胱癌的治療尋找新的方向和靶點(diǎn)。半枝蓮為唇形科植物半枝蓮的干燥全草,中醫(yī)認(rèn)為其具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛等多種功效,并具有抗癌作用[4-5],但其具體的抗癌機(jī)制及對(duì)膀胱癌細(xì)胞的作用仍有待進(jìn)一步探究。本研究使用膀胱癌T24細(xì)胞株研究半枝蓮含藥血清對(duì)其凋亡及黏附力的影響,為半枝蓮在膀胱癌中的治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞。SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(中山大學(xué),粵SCXK2021-0029),體重240～260g,6～8周齡;人膀胱癌T24細(xì)胞株(中山大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 藥品與試劑。半枝蓮提取物(10∶1水提物,蘭州沃特萊斯生物科技有限公司);10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco,內(nèi)蒙古奧普賽生物科技有限公司);胰蛋白酶(北京索寶來(lái)公司)3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT);DMSO溶液(Sigma公司);兔源一抗B-細(xì)胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Recombinant Bcl-2 Associated X Protein,Bax)抗體、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)蛋白、二抗羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司);CytoFLEX S流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特有限公司,中國(guó)),Annexin V-APC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);Fresco21離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司,中國(guó));FYL-YS-430L電熱恒溫孵育箱(北京福意電器有限公司);DM IL KED倒置熒光顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司,上海);低溫冰箱(中國(guó)海爾公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。人膀胱癌T24細(xì)胞于10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3d換液1次,至細(xì)胞融合至70%～80%用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 含藥血清制備[6]。Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后編號(hào),隨機(jī)分為無(wú)藥血清組、半枝蓮低劑量組、半枝蓮中劑量組、半枝蓮高劑量組,5只/組,半枝蓮低、中、高劑量組分別以1.5g/(kg·d)、3g/(kg·d)、6g/(kg·d)(加入10ml蒸餾水制成混懸液)灌胃,2次/d,連續(xù)灌胃3d。無(wú)藥血清組采用蒸餾水灌胃,2次/d。末次灌胃后2h將大鼠以30mg/kg、3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,固定于手術(shù)臺(tái),使用注射器經(jīng)右心室抽血,室溫下靜置凝固,2 400r/min離心10min,分離上層血清,滅活處理后以0.22μm的微孔濾膜無(wú)菌過(guò)濾后于-20℃冰箱保存。

1.2.3 細(xì)胞分組及干預(yù)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人膀胱癌T24細(xì)胞分為無(wú)藥血清組、半枝蓮低劑量組、半枝蓮中劑量組、半枝蓮高劑量組,以10%大鼠血清(各組細(xì)胞對(duì)應(yīng)各組大鼠)培養(yǎng),分別于24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各濃度下T24細(xì)胞的凋亡率,實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖情況。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞,以胰酶消化重懸,1×103個(gè)/孔接種于96孔板中恒溫培養(yǎng),設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,加入培養(yǎng)基100μl,于培養(yǎng)24h、48h時(shí)每孔加入CCK-8溶液10μl,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h,以酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=[1-(對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/對(duì)照孔A值]×100%。

1.2.5 細(xì)胞凋亡情況。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以胰酶消化重懸,4×103個(gè)/孔接種于6孔板中恒溫培養(yǎng),流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)T24細(xì)胞的凋亡周期變化。

1.2.6 細(xì)胞黏附力情況。96孔培養(yǎng)板預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠每孔10μg/50μl,于超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。96孔板中加入含有2%的BSA培養(yǎng)基,100μl/孔,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)封阻1h,PBS沖洗,加入各組細(xì)胞混懸液100μl/孔,每組5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48h,棄培養(yǎng)液,PBS洗滌,去掉未黏附細(xì)胞,加入EPMI-1640培養(yǎng)基及MTT溶液各50μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔加入150μl DMSO,震蕩10min,于酶標(biāo)儀上檢測(cè)570nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。細(xì)胞黏附率=[1-(對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/對(duì)照孔A值]×100%。

1.2.7 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。取各組培養(yǎng)48h后的T24細(xì)胞,PBS洗滌,離心收集上清,4℃環(huán)境下12 000r/min離心20min,棄上清液提取細(xì)胞蛋白,加入上樣緩沖液混勻,水浴變性,檢測(cè)蛋白濃度,以12%SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2h,TBST洗滌,加入Bcl-2、Bax、Caspase-3及內(nèi)參蛋白GAPDH一抗孵育液,4℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌,加入二抗孵育2h,TBTS洗滌,顯色、成像使用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 半枝蓮含藥血清對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖影響 各組細(xì)胞24h及48h的增殖抑制率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);均為:半枝蓮高劑量組>半枝蓮中劑量組>半枝蓮低劑量組>無(wú)藥血清組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 半枝蓮含藥血清對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡影響各組細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞周期G0/G1期、S期、G2期比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);凋亡率、GO/G1顯示:無(wú)藥血清組<半枝蓮低劑量組<半枝蓮中劑量組<半枝蓮高劑量組(P<0.05);S、G2顯示:無(wú)藥血清組>半枝蓮低劑量組>半枝蓮中劑量組>半枝蓮高劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡及周期情況比較

2.3 半枝蓮含藥血清對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞黏附力影響 各組細(xì)胞黏附率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.362,P<0.001),即無(wú)藥血清組(27.22±4.20)%<半枝蓮低劑量組(35.66±5.41)%<半枝蓮中劑量組(45.44±6.58)%<半枝蓮高劑量組(56.50±8.42)%(F=19.662,P<0.05)。

2.4 半枝蓮含藥血清對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、CASP3相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Bcl-2顯示:無(wú)藥血清組>半枝蓮低劑量組>半枝蓮中劑量組>半枝蓮高劑量組(P<0.05);Bax、CASP3顯示:無(wú)藥血清組<半枝蓮低劑量組<半枝蓮中劑量組<半枝蓮高劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,癌細(xì)胞的凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移是病情進(jìn)展及預(yù)后不佳的重要因素。凋亡是細(xì)胞自身調(diào)節(jié)的一種機(jī)制,在腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,可以防止腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增生和擴(kuò)散,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡和清除[7]。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤增殖生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特性,與治療效果及預(yù)后息息相關(guān),細(xì)胞與其周圍基質(zhì)間的黏附情況是影響其侵襲能力的重要因素[8]。因此,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,增加其黏附力,從而抑制侵襲、轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤的治療中有重要作用。

目前靶向治療為惡性腫瘤的重要治療方式之一,關(guān)于膀胱癌的靶向治療藥物有BGJ398、多韋替尼、厄達(dá)替尼等,但存在藥物安全性及治療準(zhǔn)確性等問(wèn)題。隨著中醫(yī)藥在癌癥治療中研究的深入,中草藥被證實(shí)能從多層面、多環(huán)節(jié)和多部位發(fā)揮明顯的多靶點(diǎn)效應(yīng),成為惡性腫瘤靶向治療的研究熱點(diǎn)。半枝蓮屬中醫(yī)藥中清熱解表藥物,其性溫、苦、寒,歸肺、腎經(jīng),具有清熱解毒、活血化瘀及利水消腫的作用[9]。現(xiàn)代藥理研究表明,半枝蓮中含有黃酮類、二萜類、二萜內(nèi)酯類及多糖等化學(xué)成分,具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝等多種作用[10],因此被應(yīng)用于癌癥的相關(guān)研究。目前關(guān)于含有半枝蓮的中藥復(fù)方制劑及半枝蓮有效成分的抗癌作用已有較多研究,但關(guān)于其在人前列腺癌方面的研究較少。張峰等在體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),半枝蓮總黃酮能上調(diào)遷移侵襲蛋白的表達(dá),抑制人胃腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,提高其放療敏感性[11]。劉明勝等將半枝蓮醇提取物應(yīng)用于結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116,結(jié)果表明半枝蓮醇提取物能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的克隆形成,促進(jìn)凋亡,其機(jī)制可能與調(diào)控circ_0092283/miR-198通路有關(guān)[12]。亦有相關(guān)研究證實(shí)半枝蓮及其相關(guān)提取物在乳腺癌、肝細(xì)胞癌中均發(fā)揮良好的抗癌效果[13-14]。本研究中,與無(wú)藥血清組比較,半枝蓮低/中/高劑量組的增殖抑制率、凋亡率且其變化程度與劑量有明顯的關(guān)系,這說(shuō)明半枝蓮含藥血清可抑制人膀胱癌T24細(xì)胞的增殖,提高細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附力,有明顯的體外抗膀胱癌活性。

細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白和細(xì)胞存活調(diào)節(jié)蛋白平衡的影響。Bcl-2家族蛋白在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑中有重要作用,在癌細(xì)胞中屬于抗凋亡蛋白,其過(guò)度表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒素的抵抗性,抑制多數(shù)腫瘤化療藥物引起的靶細(xì)胞凋亡[15]。Bax亦屬于Bcl-2家族成員,為促凋亡蛋白,能引起線粒體外膜的透化觸發(fā)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞中的Bax蛋白被激活后可釋放凋亡信號(hào)因子,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。Bcl-2與Bax的比值失衡則可造成細(xì)胞的過(guò)度凋亡或過(guò)度增殖,影響細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。CASP3是保守蛋白質(zhì)家族中廣泛表達(dá)的成員,能特異性地切割天冬氨酸殘基上的肽鍵,引起細(xì)胞凋亡,是多種細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)所有凋亡蛋白中的主要執(zhí)行對(duì)象,直接參與調(diào)控凋亡,導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、被吞噬敏感性增加[17]。本研究中經(jīng)半枝蓮含藥血清干預(yù)的各組細(xì)胞G0/G1期、Bax與CASP3相對(duì)表達(dá)量增加均增加,細(xì)胞S期、G2期及Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降,且呈劑量依賴性,說(shuō)明半枝蓮含藥血清能在體外將膀胱癌T24細(xì)胞阻滯于G0/G1期,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,與既往對(duì)半枝蓮抗癌作用研究的特性相符。趙鴻翔等[18]進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,雄性SD大鼠腦室內(nèi)注射β淀粉樣蛋白25-35、三氯化鋁及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,能引起線粒體凋亡因子Bcl-2、Bax、Bal-xL及Bak的異常改變,半枝蓮黃酮能逆轉(zhuǎn)這一改變,可說(shuō)明半枝蓮能通過(guò)增加Bax的表達(dá),抑制Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)人膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖,發(fā)揮相關(guān)抗癌作用。

綜上所述,半枝蓮含藥血清能抑制人膀胱癌T24細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)凋亡,提高細(xì)胞黏附力,可作為抗膀胱癌藥物進(jìn)行研究。本研究的不足之處在于僅從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面驗(yàn)證了半枝蓮在對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞的抗癌作用,后續(xù)仍需進(jìn)一步建立動(dòng)物皮下移植瘤模型,深入進(jìn)行多機(jī)制探討,為膀胱癌的防治研究提供更加全面的參考。