衡利冰，夏永軍，艾連中，劉欣欣

上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院/上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

乳酸菌能夠用于生產(chǎn)酸乳、乳酪、風(fēng)味泡菜、發(fā)酵飲料等具有保健功能的食品。植物乳桿菌作為一種常見(jiàn)乳酸菌，因其抗衰老、減輕腸道生態(tài)平衡[1]等功能而愈發(fā)受消費(fèi)者重視與喜愛(ài)了[2]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為乳桿菌科乳桿菌屬，不產(chǎn)芽孢、兼性厭氧或厭氧、可用于食品加工產(chǎn)業(yè)的革蘭氏陽(yáng)性菌，形狀為直桿狀或彎桿狀[3]，是一種重要的益生菌，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道菌群平衡、改善腸道內(nèi)環(huán)境、增強(qiáng)免疫力和抵抗力等多種功能[4-6]。近年來(lái)，植物乳桿菌開(kāi)始被應(yīng)用于泡菜、豆腐等產(chǎn)品的發(fā)酵中，有益于人體健康，已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。

目前，有關(guān)益生菌的研究日漸增多，但將其應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中仍具有一定的局限性。植物乳桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化研究快速發(fā)展，但其工業(yè)化應(yīng)用仍處于起步階段。工業(yè)上常以MRS 培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，一些學(xué)者研究了添加緩沖鹽和化學(xué)中和劑以促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的方法[7]。Choi GH 等[8]用OFAT 法篩選碳源、氮源等，通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到菌株生物量為3.845 g/L，為優(yōu)化培養(yǎng)基的2.429 倍。Chen H 等[9]通過(guò)優(yōu)化碳源、氮源、有效因子等，得知磷酸氫二鉀為促生長(zhǎng)因子，各物質(zhì)的添加量為葡萄糖21 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉8 g/L，酵母浸出粉8 g/L，磷酸氫二鉀3.5 g/L，CH3COONa 6.5 g/L，C6H14O7N22 g/L，MgSO40.2 g/L，吐溫80 1 mL/L 時(shí)，最大活菌數(shù)可以達(dá)到2.72×109CFU/mL。孫雨佳等通過(guò)單因素、爬坡實(shí)驗(yàn)與中心組合實(shí)驗(yàn)確定了植物乳桿菌NCU137 最佳培養(yǎng)基的成分為麥芽糖26.73 g/L，酵母浸粉21.8 g/L，大豆蛋白胨16.59 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，MnSO4·H2O 0.06 g/L，腺嘌呤0.13 g/L，苯丙氨酸0.051 g/L，吐溫80 為1 mL/L，最終活菌數(shù)高達(dá)9.2×109CFU/mL。植物乳桿菌AR307 是上海理工大學(xué)食品微生物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室從四川泡菜中篩獲的一種乳酸菌，具有降血糖、抑制腫瘤、抑制α-淀粉酶等作用。根據(jù)植物乳桿菌AR307 的生長(zhǎng)需求，調(diào)整MRS 培養(yǎng)基碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的含量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)、Box-Behnken 試驗(yàn)，旨在提高植物乳桿菌AR307 的菌體密度，為AR307 產(chǎn)業(yè)化、工業(yè)化大劑量發(fā)酵提供理論依據(jù)[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌AR307，由上海理工大學(xué)食品微生物工程技術(shù)研究中心保藏；

MRS 培養(yǎng)基：酪蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，乙酸鈉8.3 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L;

MRS 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20.0 g/L 的瓊脂；

果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、低聚木糖、木糖、海藻糖、殼寡糖、淀粉、抗性糊精、菊粉、胰蛋白胨。

PL2002 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，奧地利美谷分子；DU-800 分光光度計(jì)，Beckman 公司；Ruskinn 低氧厭氧培養(yǎng)工作站，英國(guó)Ruskinn；BPH-G082 型精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Bioscreen C 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，芬蘭Oy Growth Curves Ab 公司；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 菌株培養(yǎng)

將于-80 ℃保藏的植物乳桿菌AR307 在固體MRS 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h 后，挑取單菌落于液體MRS 培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h 后，以1%的比例接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

分別選擇不同的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽作為影響菌株活性的主要因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)選擇影響因素與水平。

1.3.1 最佳碳源的確定

在MRS 培養(yǎng)基中分別加入2%的果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、低聚木糖、木糖、海藻糖、殼聚、淀粉、抗性糊精、菊粉、葡萄糖，研究不同種類(lèi)的碳源對(duì)植物乳桿菌AR307 生長(zhǎng)的影響，篩選出最佳碳源后選擇不同濃度的碳源加入MRS，研究碳源濃度對(duì)菌株的影響，菌株接種量均為1%，37 ℃培養(yǎng)24 h，生長(zhǎng)曲線儀測(cè)定菌體的OD600。

1.3.2 最佳氮源的確定

在MRS 培養(yǎng)基中分別添加酵母浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨，研究不同氮源對(duì)植物乳桿菌AR307 生長(zhǎng)的影響，又研究了復(fù)配氮源及不同濃度的氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，菌株接種量均為1%，37 ℃培養(yǎng)24 h，生長(zhǎng)曲線儀測(cè)定菌體的OD600。

1.3.3 無(wú)機(jī)鹽的確定

在MRS 培養(yǎng)基中分別加入磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、三水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨，研究不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)植物乳桿菌AR307 生長(zhǎng)的影響，又研究了復(fù)配無(wú)機(jī)鹽及不同濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，菌株接種量均為1%，37 ℃培養(yǎng)24 h，生長(zhǎng)曲線儀測(cè)定菌體的OD600。

1.4 BOX-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)（Box-Behnken）原理，選取對(duì)植物乳桿菌AR307 生長(zhǎng)影響較大的單因素碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽為自變量，以O(shè)D600（分光光度計(jì)）為響應(yīng)值，得到其在各個(gè)影響因素下的最大值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以確定植物乳桿菌AR307 生長(zhǎng)的培養(yǎng)基成分，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

碳源作為微生物生長(zhǎng)過(guò)程中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以為乳酸菌生長(zhǎng)提供能量，加快物質(zhì)向細(xì)胞的傳輸速度，加快細(xì)胞的合成和新陳代謝，促進(jìn)乳酸菌的快速增殖[11]。不同碳源對(duì)植物乳桿菌AR307 生長(zhǎng)與產(chǎn)生的影響如圖1（a）所示，在以麥芽糖為碳源時(shí)，AR307 生長(zhǎng)最快，OD600在培養(yǎng)至12 h 時(shí)達(dá)到1.6，這與董子興等[12]的研究結(jié)果一致，菌株對(duì)殼聚糖、木糖、淀粉、抗性糊精等的利用率較低，幾乎不生長(zhǎng)，因此確定麥芽糖為最佳碳源。接下來(lái)，對(duì)麥芽糖的添加量進(jìn)行探究，如圖1（b）所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著添加量的增加，菌體密度逐漸增加，在麥芽糖濃度為3%后呈下降趨勢(shì)，這可能由于碳源濃度過(guò)高，抑制了植物乳桿菌AR307 的生長(zhǎng)，最終選取2.5%、3%、3.5%作為響應(yīng)面的三個(gè)濃度。

圖1 不同碳源優(yōu)化的生長(zhǎng)曲線圖

2.2 氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

氮源作為微生物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)素，主要用于蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和輔酶等物質(zhì)的合成[13]。蛋白胨含有豐富的氨基酸，特別是含硫氨基酸較多，還含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需的維生素和其他生長(zhǎng)因子，是各種培養(yǎng)基制備的基礎(chǔ)原材料，主要作用是提供氮源。本研究將MRS 培養(yǎng)基中的氮源替換為酵母浸粉、牛肉浸出粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨及復(fù)合氮源，發(fā)酵24 h，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，探究不同氮源對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。如圖2（a）所示，添加單一氮源酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的效果與添加復(fù)合氮源的效果存在一定的差異，例如單純添加胰蛋白胨可以抑制菌株生長(zhǎng)，但復(fù)合氮源可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，因此考慮對(duì)幾種氮源進(jìn)行復(fù)配使用，既可以滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)的需求，又可以降低成本，取得更好的效果[14]。當(dāng)酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的添加比例為1∶1∶1 時(shí)最有利于植物乳桿菌生長(zhǎng)。接下來(lái)，對(duì)復(fù)合氮源的添加量進(jìn)行探究，結(jié)果如圖2（b）所示，隨著氮源添加量的增加，菌體密度逐漸增加，當(dāng)?shù)刺砑恿繛?.5%時(shí)，菌體密度達(dá)到1.63；但當(dāng)添加量超過(guò)1.5%時(shí)，菌體密度降低。這可能是由于植物乳桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中需要足夠的氮源，濃度較低營(yíng)養(yǎng)不充分會(huì)影響其生長(zhǎng)，但濃度過(guò)高又會(huì)使有機(jī)酸不斷積累從而抑制菌株生長(zhǎng)，最終選取1.5%、2%、2.5%作為響應(yīng)面的三個(gè)濃度。

圖2 不同氮源優(yōu)化的生長(zhǎng)曲線圖

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

乳酸菌高密度培養(yǎng)過(guò)程補(bǔ)充的無(wú)機(jī)鹽主要是作為緩沖物質(zhì)，來(lái)調(diào)節(jié)菌體生長(zhǎng)過(guò)程中pH 的變化的，維持適宜乳酸菌生長(zhǎng)的pH 環(huán)境，延長(zhǎng)發(fā)酵劑的活性[11]。磷酸鹽在培養(yǎng)基中具有調(diào)節(jié)pH 和緩沖等作用，在MRS 培養(yǎng)基中添加相同比例的單一無(wú)機(jī)鹽或復(fù)合無(wú)機(jī)鹽，考察不同緩沖鹽對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，以菌株生長(zhǎng)OD600值的大小為標(biāo)準(zhǔn)，如圖3（a）所示，選用磷酸氫二鉀時(shí)菌體密度最大，最終確定無(wú)機(jī)離子為磷酸氫二鉀。進(jìn)一步對(duì)磷酸氫二鉀的添加量進(jìn)行了濃度試驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著添加量的增加，菌體密度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)如下圖3（b），最終選取0.7%、0.8%、0.9%三個(gè)濃度開(kāi)展響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化的生長(zhǎng)曲線圖

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以碳源添加量、氮源添加量、無(wú)機(jī)鹽添加量為影響因素，以O(shè)D600為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基的添加比例。選取三因素的Box-Behnken 擬合二階響應(yīng)面三水平設(shè)計(jì)，共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)為分析因子，5 個(gè)為零點(diǎn)，響應(yīng)值Y 為OD600，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)表進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立OD600的回歸模型如圖表3 所示。回歸方程Y=6.2+0.39X1+0.088X2+0.1X3-0.23X1X2+0.1X1X3+0.1X2X3-0.54X12-0.29X22-0.71X32，其中A、A2與C2為極顯著差異（P＜0.01）。模型擬合的決定系數(shù)（R2）和校正決定系數(shù)（RAdj值）分別為0.907 2 和0.787 9，C.V.%為5.29＜10，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度較高，模型的P＜0.01，具有顯著性，失擬項(xiàng)P 值為0.051 1，不顯著（P＞0.05），表明模型的顯著性較好，各因素對(duì)植物乳桿菌AR307 的影響次序?yàn)樘荚矗緹o(wú)機(jī)鹽＞氮源，其中碳源的影響最大[15]。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

圖4 是回歸方程得到的曲面與等高線圖，主要反映了碳源、氮源與無(wú)機(jī)鹽之間的相互作用，碳源與無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株OD600的交互效應(yīng)較強(qiáng)，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較為陡峭；碳源與氮源對(duì)菌株OD600的交互作用次之；氮源與無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株OD600的交互效應(yīng)較差，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較為平緩。由方程可知，二項(xiàng)式系數(shù)為負(fù)值，表明方程擁有最大值。利用Design-Expert10.0 分析計(jì)算，最適發(fā)酵培養(yǎng)基為碳源添加3.5%、氮源添加2.21%、無(wú)機(jī)鹽添加0.75%，此時(shí)的OD600值最大為6.4。

圖4 各因素交互作用對(duì)AR307 菌株OD600 的影響曲面和等高線

3 結(jié)論

本研究對(duì)植物乳桿菌AR307 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及添加量進(jìn)行了優(yōu)化，以單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)建立了二次多項(xiàng)式回歸模型。單因素試驗(yàn)確定促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的最優(yōu)碳源為麥芽糖、氮源為復(fù)合氮源、無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀，由回歸方程的擬合結(jié)果得知菌株生長(zhǎng)的最佳碳源添加量為3.5%、氮源添加量為2.21%、無(wú)機(jī)鹽添加量為0.75%，確定了植物乳桿菌AR307 的最適培養(yǎng)基。在此優(yōu)化條件下，植物乳桿菌AR307 的OD600值為6.4，菌體密度得到了提升，植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究為今后工業(yè)化生產(chǎn)植物乳桿菌奠定了基礎(chǔ)，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和發(fā)展前景。