姜學(xué)權(quán)，汪浩勇

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌是一種高效的乙醇生產(chǎn)菌株，有許多理想的工業(yè)生物催化劑特性[1]。它的代謝途徑已得到廣泛研究，有助于揭示其高乙醇生產(chǎn)率和耐受性的機(jī)制。

目前，微生物的干燥方法通常包括冷凍干燥、噴霧干燥和真空干燥[2]。相比其他干燥方法，鼓風(fēng)干燥操作簡(jiǎn)單，可顯著降低成本，同時(shí)能達(dá)到預(yù)期的干燥效果[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖作為干燥保護(hù)劑能起到脫水保護(hù)的作用，并且不含原基，不會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生褐變反應(yīng)從而變質(zhì)失活，甘油可以清除自由基及活性氧，這有助于防止變性和其他形式的損壞[4]。

本研究以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌為研究對(duì)象，采用固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，使用顯微鏡計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量，利用鼓風(fēng)干燥法處理細(xì)菌，通過(guò)添加可能的保護(hù)劑分析其對(duì)細(xì)菌存活率的影響，最后采用發(fā)酵方式分析鼓風(fēng)干燥運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌由湖北工業(yè)大學(xué)汪浩勇老師實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 原料

豆粕和麩皮均購(gòu)自河北油脂有限公司，含水率分別為11.3%和11.8%。

1.1.3 培養(yǎng)基

固態(tài)培養(yǎng)基：豆粕7 g，麩皮3 g，混合后121 ℃滅菌20 min。

ZM 液態(tài)培養(yǎng)基：25%葡萄糖，1%酵母提取物，0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，pH 6.0～7.0，115 ℃滅菌30 min。

ZM 活化培養(yǎng)基：10%葡萄糖，1%酵母提取物，0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，pH 6.0～7.0，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250-B 型生化培養(yǎng)箱，上海福碼公司；LS-335L-I 型高壓蒸汽滅菌鍋，江陰賓江醫(yī)療有限公司；PH50-3A43L 型顯微鏡，蘇州光學(xué)神鷹有限公司；101-2B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，恒諾利興科技有限公司；DHS-10A 型電子水分測(cè)定儀，邦西儀器科技有限公司；CJ-2D 型超凈工作臺(tái)，天津泰斯特。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的固態(tài)培養(yǎng)

使用豆粕作為原料提供細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，麩皮作為輔料改善培養(yǎng)基的通透性。豆粕與麩皮質(zhì)量比為7∶3 的混合原料10 g，5%的活化菌液混在無(wú)菌水溶液（含有0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，5%葡萄糖）中，取10 g 加到混合原料中混勻，在33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)。

1.3.2 鼓風(fēng)干燥及保護(hù)劑添加

分別用滅菌的淀粉、乳糖和麥芽糖與培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌固態(tài)培養(yǎng)基等質(zhì)量混合。固態(tài)培養(yǎng)基和保護(hù)劑各稱取4 g（培養(yǎng)基是濕重，含有50.39%的水分），混勻后放在39 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱風(fēng)吹，直至含水率低于10%。

1.3.3 組合保護(hù)劑的選擇

培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的固態(tài)培養(yǎng)基與乳糖等質(zhì)量混勻后，分別添加固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，4%，6%，8%的甘油到其中，另一組分別添加固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，10%，15%，20%的甘露糖，混勻后放在39 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱風(fēng)吹，直至含水率低于10%。

1.3.4 發(fā)酵試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)鼓風(fēng)干燥的菌株用無(wú)菌水懸浮起來(lái)，以5%的接種量加入葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，瓶口用活塞塞緊，并添加石蠟油密封，第一次稱重并記錄，發(fā)酵瓶置于恒溫?fù)u床中超過(guò)72 h。結(jié)束后進(jìn)行第二次稱重。

1.3.5 細(xì)菌總數(shù)及活菌數(shù)的確定

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)結(jié)束后，加水約45 g 將細(xì)菌懸浮起來(lái)，取50 μL 懸液，將其加到有950 μL 無(wú)菌水的EP 管中混勻，取10 μL 于血球計(jì)數(shù)板，用顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。

鼓風(fēng)干燥結(jié)束后，加入大約45 g 水將細(xì)菌懸浮起來(lái)，混勻后取10 μL 加到含有30 μL 水的八連管中，取10 μL 亞甲基藍(lán)溶液加入其中進(jìn)行染色，染色時(shí)間大約1 min，取10 μL 染色液于血球計(jì)數(shù)板上，用顯微鏡拍照統(tǒng)計(jì)細(xì)菌總數(shù)和活細(xì)菌數(shù)。其中在顯微鏡下觀察到藍(lán)色的細(xì)菌為死細(xì)菌，顏色沒(méi)有變化的是活細(xì)菌。細(xì)菌數(shù)/g=N×256×5 000×稀釋倍數(shù)（N 為顯微鏡下觀察到的細(xì)菌數(shù)）

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌固態(tài)培養(yǎng)

以豆粕7 g 和麩皮3 g 混合作為固態(tài)培養(yǎng)基，5%的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌與無(wú)菌水（含有0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，5%葡萄糖）混勻后取10 g 加入固態(tài)培養(yǎng)基中，在33 ℃下培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察到的形態(tài)如圖1 所示，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在顯微鏡下呈圓形、無(wú)色透明狀態(tài)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算得出細(xì)菌數(shù)達(dá)到1.85×1010CFU/g。表明在此條件下能夠培養(yǎng)出足夠多的細(xì)菌。

圖1 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌顯微鏡下的形態(tài)

2.2 鼓風(fēng)干燥的主要保護(hù)劑選擇

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)24 h 后，淀粉、麥芽糖、乳糖作為保護(hù)劑與培養(yǎng)細(xì)菌的固態(tài)培養(yǎng)基1∶1 混勻，以不添加任何保護(hù)劑的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，然后放在39 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)吹干燥，直到含水量低于10%。麥芽糖和乳糖經(jīng)過(guò)稀釋后，可以在顯微鏡下清楚地觀察到細(xì)菌，可以作為保護(hù)劑與固態(tài)培養(yǎng)基1∶1 混勻進(jìn)行鼓風(fēng)干燥。麥芽糖和乳糖作為保護(hù)劑進(jìn)行熱風(fēng)干燥后，細(xì)菌總數(shù)和活菌數(shù)分別為1.38×1010CFU/g、7.27×109CFU/g，1.05×1010CFU/g、9.07×109CFU/g。其對(duì)應(yīng)的存活率分別為52.49%和86.34%。對(duì)照組總細(xì)菌數(shù)為7.35×109CFU/g，活菌數(shù)只有2.79×109CFU/g，存活率為37.91%。雖然添加麥芽糖后，細(xì)菌總數(shù)達(dá)到最高，但其保護(hù)效果不明顯，而添加乳糖后，存活率明顯比對(duì)照組和添加麥芽糖的高，且細(xì)菌總數(shù)也比對(duì)照組有明顯增加。因此，選擇乳糖作為鼓風(fēng)干燥的主要保護(hù)劑。

2.3 組合保護(hù)劑選擇

固態(tài)培養(yǎng)基等質(zhì)量的乳糖分別與5%，10%，15%，20%的甘露糖為組合保護(hù)劑。當(dāng)添加5%的甘露糖后，細(xì)菌總數(shù)達(dá)到1.26×1010CFU/g，活菌數(shù)也高達(dá)1.19×1010CFU/g，細(xì)菌數(shù)顯著比對(duì)照組多，其存活率超過(guò)94%。進(jìn)一步增加其添加量，細(xì)菌總數(shù)明顯減少。表明在鼓風(fēng)干燥過(guò)程中，添加5%的甘露糖能有效地增加細(xì)菌數(shù)，提高細(xì)菌存活率。

固態(tài)培養(yǎng)基等質(zhì)量的乳糖分別與2%，4%，6%，8%的甘油作為組合保護(hù)劑。添加2%和4%的甘油后進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，細(xì)菌總數(shù)分別達(dá)到1.38×1010CFU/g 和1.26×1010CFU/g，而活菌數(shù)也分別高達(dá)1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g，細(xì)菌總數(shù)明顯比對(duì)照組多，存活率超過(guò)94%。在鼓風(fēng)干燥過(guò)程中，添加一定量的甘油能有效地使細(xì)菌從固形物中脫離下來(lái)，從而能在顯微鏡中觀察到更多的細(xì)菌。當(dāng)甘油的添加量增加時(shí)，細(xì)菌數(shù)有所減少，過(guò)多的甘油添加量也會(huì)減少細(xì)菌數(shù)量。鼓風(fēng)干燥過(guò)程中，2%～4%的甘油添加不僅能有效地提高細(xì)菌總數(shù)，還能提高細(xì)菌干燥存活率。

2.4 發(fā)酵試驗(yàn)

鼓風(fēng)干燥結(jié)束后，用無(wú)菌水將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌懸浮起來(lái)，吸取1 mL 接種于25%的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基質(zhì)量為30 g，用電子天平稱整個(gè)發(fā)酵瓶的質(zhì)量，在34 ℃下培養(yǎng)72 h，結(jié)束后再稱其質(zhì)量，計(jì)算其失重。結(jié)果如表1 所示，干燥后的失重值為0.100 1 g/g，與沒(méi)有干燥菌株的失重結(jié)果非常接近，表明鼓風(fēng)干燥方式可用于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的干燥。

表1 發(fā)酵失重結(jié)果（單位：g）

3 結(jié)論

在5%接菌量、5%葡萄糖濃添加量、加水量10 g、33 ℃條件下培養(yǎng)時(shí)間24 h，獲得的細(xì)菌數(shù)為1.85×1010CFU/g。在39 ℃下進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，固態(tài)培養(yǎng)基等質(zhì)量的乳糖與5%的甘露糖作為組合保護(hù)劑，活菌數(shù)達(dá)到1.19×1010CFU/g，存活率超過(guò)94%，對(duì)鼓風(fēng)干燥有明顯的保護(hù)效果。固態(tài)培養(yǎng)基等質(zhì)量的乳糖分別與2%或4%的甘油作為組合保護(hù)劑，活菌數(shù)分別達(dá)到1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g，存活率超過(guò)94%。干燥前后的菌株都具有較好的發(fā)酵能力。