胡玉潔綜述， 徐運(yùn)審校

卒中是全球的第二大死因，也是導(dǎo)致長期殘疾的主要原因。87%的卒中是缺血性卒中，每年全球約有80萬人罹患缺血性卒中［1］。腦血流的突然中斷導(dǎo)致細(xì)胞能量耗竭并迅速死亡，繼發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和組織損傷。缺血性卒中的病理生理機(jī)制涉及興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等過程。CARD是由約90個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡、炎癥和先天細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起作用［2］。近年來，CARD蛋白家族已被廣泛證明與缺血性卒中相關(guān)。CARD蛋白家族通過激活轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞凋亡，從而直接或間接地影響缺血性卒中的發(fā)展和預(yù)后。本文就CARD蛋白家族調(diào)控缺血性卒中進(jìn)行歸納和分析，進(jìn)一步闡述CARD蛋白的作用機(jī)制，為今后探究CARD蛋白在缺血性卒中中的臨床轉(zhuǎn)化提供潛在靶點(diǎn)和研究基礎(chǔ)。

1 CARD家族概述

CARD家族屬于死亡結(jié)構(gòu)域超家族，以包含一個6個或7個反平行α螺旋束的結(jié)構(gòu)為特征［3］。CARD能夠通過同型相互作用和與含CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用促進(jìn)大型寡聚信號復(fù)合物的組裝。根據(jù)整體結(jié)構(gòu)域的區(qū)別可以將CARD蛋白分為四個亞家族：（1）核苷酸結(jié)合域（nucleotide-binding domian，NBD）-CARDs：Apaf-1、NOD1、NOD2、CARD7、CARD12；（2）coiled-coil-CARDs：CARD9、CARD11（CARMA1）、CARD14（CARMA2）、CARD10（CARMA3）；（3）bipartite-CARDs：RIPK2（CARD3）、Bcl10、CARDD、PYCARD/ASC、ARC、半胱天冬酶（Caspase）-1、Caspase-2、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-9、CARD8；（4）CARD-only proteins（COPs）：PSEUDO-ICE/CARD18、ICEBERG/CARD16［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)CARD與多種腫瘤、心血管疾?。ǜ哐獕?、心肌梗死、動脈粥樣硬化）、自身免疫性疾?。◤?qiáng)直性脊柱炎）、炎癥性疾?。肆_恩?。⑵つw?。ㄣy屑病、特異性皮炎、真菌感染性疾病）相關(guān)，提示其在多種病理生理過程中具有重要作用［5-7］。

2 NBD-CARDs與缺血性卒中

2.1 Apaf-1 細(xì)胞凋亡激活因子-1（Apaf-1）是細(xì)胞應(yīng)激或損傷的傳感器，也是細(xì)胞凋亡線粒體通路中激活Caspase的關(guān)鍵分子［8］。在細(xì)胞凋亡期間，Apaf-1通過CARD-CARD相互作用促進(jìn)Caspase-9活化，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)。Apaf-1在腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠中顯著升高［9］。Apaf-1相互作用蛋白AIP是Caspase-9的新型短變體，包含CARD結(jié)構(gòu)域，但缺乏Caspase-9所具有的催化結(jié)構(gòu)域。小鼠體內(nèi)過表達(dá)AIP可以有效抑制MCAO后的細(xì)胞凋亡，提示靶向Apaf-1-Caspase-9信號通路可能是一種可行的缺血性卒中的神經(jīng)保護(hù)策略［10］。

2.2 NOD1、NOD2 先天免疫依賴于跨膜Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體（NOD-like receptors，NLR）來誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。核酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域1（NOD1）是NLR家族的成員。NOD1在MCAO小鼠海馬中顯著上調(diào)，NOD1配體DAP顯著增加MCAO小鼠自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62和LC3BII的表達(dá)，激活NF-κB通路，擴(kuò)大梗死體積并加重神經(jīng)功能缺損［11］。NOD2在體外氧糖剝奪的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中升高，通過NOD2/MAPK/NF-κB信號通路介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥［12］。研究表明，NOD2參與腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)，NOD2基因敲除能改善缺血性卒中的預(yù)后［13］。因此，NOD1/2是減輕缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)。

3 coiled-coil-CARDs 與缺血性卒中

3.1 CARD9 在多種細(xì)胞，特別是免疫細(xì)胞中表達(dá)，參與先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，與感染、炎癥、腫瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病相關(guān)。CARD9是Bcl-10和NF-κB、MAPK信號傳導(dǎo)的上游激活劑，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［14］。在MCAO小鼠中，骨髓細(xì)胞上表達(dá)的TREM-1可以通過與SYK相互作用來激活下游促炎途徑CARD9/NF-κB和NLRP3/Caspase-1［15］。CARD9在缺血性卒中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3.2 CARMA CARD10、CARD11、CARD14都屬于CARMA蛋白［16］。在一項(xiàng)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的研究中，CARD11被鑒定為缺血性卒中的免疫相關(guān)遺傳生物標(biāo)志物［17］。

黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1（mucosaassociated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1，MALT1），是一種參與NF-κB信號通路的多功能蛋白。MALT1在調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)的大量基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用。MALT1能夠調(diào)節(jié)先天性自然殺傷細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞）中促炎基因的表達(dá)［18］。MALT1與Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子呈正相關(guān)，也與急性缺血性卒中的疾病風(fēng)險、嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)［19］。

4種coiled-coil-CARDs都可以與Bcl10和MALT1形成CBM（CARD-Bcl10-MALT1）復(fù)合物。CBM復(fù)合物是一種控制免疫和炎癥通路的多蛋白信號平臺，調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK信號通路（A20、HOIL1、CYLD、RELB）和mRNA結(jié)合蛋白（regnase1、roquin1、roquin2）的降解，在免疫缺陷疾病、炎癥性疾病和免疫系統(tǒng)癌癥中發(fā)揮重要作用［16］。CBM復(fù)合物參與DNA損傷誘導(dǎo)的NF-κB活化，并阻止細(xì)胞凋亡［20］。研究發(fā)現(xiàn)，A20可以通過去泛素化RIPK3發(fā)揮抗壞死作用，然而在缺血性卒中的大鼠模型中MALT1通過增強(qiáng)A20的降解來促進(jìn)大腦的壞死［21］。目前CARMA和CBM復(fù)合物在缺血性卒中中的研究較少，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 bipartite-CARDs與缺血性卒中

4.1 RIPK2/CARD3 受體相互作用蛋白2（RIPK2/CARD3）是NOD2下游的信號銜接蛋白，增強(qiáng)IKKγ/NF-κB必需修飾物（NEMO）的泛素化。CARD3水平在小鼠大腦缺血再灌注損傷后的腦組織中以時間依賴性方式顯著上調(diào)。敲除CARD3能減少梗死體積，改善神經(jīng)病理學(xué)評分，減輕炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡；而神經(jīng)元特異性的CARD3過表達(dá)擴(kuò)大了腦梗死體積，加重了神經(jīng)功能缺損并且增強(qiáng)缺血性卒中后的炎癥反應(yīng)。MAPKs家族成員，如JNK、ERK和p38在缺血性卒中后迅速被激活。值得注意的是，再灌注6 h后，磷酸化的JNK和p38在CARD3敲除小鼠中明顯降低，但在神經(jīng)元特異性CARD3過表達(dá)的小鼠中顯著升高，兩種情況中p-ERK都沒有明顯變化，這提示CARD3可能通過MAPK通路加重缺血再灌注損傷。轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1（TAK1）被廣泛認(rèn)為是3種傳統(tǒng)MAPKs通路的共同調(diào)節(jié)因子，神經(jīng)元特異性CARD3過表達(dá)小鼠MCAO后TAK1的激活顯著增強(qiáng)，而在CARD3敲除小鼠中則降低。TAK1特異性抑制劑顯著減少了神經(jīng)元特異性CARD3過表達(dá)小鼠MCAO后的梗死體積，減輕了缺血相關(guān)的炎癥和細(xì)胞凋亡［22］。CARD3不僅可以調(diào)節(jié)炎癥還可以通過促進(jìn)神經(jīng)元凋亡誘導(dǎo)缺血再灌注損傷，提示靶向CARD3具有緩解缺血性卒中的潛力，能否開發(fā)一種跨血腦屏障的CARD3拮抗劑仍有待進(jìn)一步研究。

4.2 PYCARD PYCARD是炎癥小體的重要組成成分，包含N端Pyrin結(jié)構(gòu)域（PYD）和C端CARD結(jié)構(gòu)域。PYCARD與活化的NLRP3寡聚體中的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并通過PYD-PYD同源型結(jié)構(gòu)域相互作用形成同源寡聚體纖維，進(jìn)一步聚集形成PYCARD寡聚體和大的PYCARD斑點(diǎn)，招募并激活pro-Caspase-1，維持長時間的炎癥小體激活［23］。PYCARD寡聚體可以被釋放到細(xì)胞間隙，被鄰近的炎性細(xì)胞吸收以維持持續(xù)的免疫反應(yīng)。He等［24］研究發(fā)現(xiàn)，重組PYCARD激活NLRP3，誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，惡化了復(fù)發(fā)性缺血性卒中的結(jié)局。

4.3 CARD8 CARD8作為一種銜接分子，負(fù)調(diào)控Caspase-1依賴性IL-1β的產(chǎn)生，并抑制NF-κB的激活［25］。CARD8編碼C10X變異體外顯子5的無意義T30A多形現(xiàn)象（rs2043211）與中國人群大動脈粥樣硬化卒中相關(guān)。Gu等［26］研究了中國人群中CARD8在大動脈粥樣硬化卒中患者中的表達(dá)和rs2043211的影響。結(jié)果表明，rs2043211變異純合子T/T與左心耳卒中風(fēng)險顯著增加相關(guān)，具有T/T基因型的高血壓患者發(fā)生左心耳卒中的風(fēng)險更高，風(fēng)險等位基因T使CARD8表達(dá)增加，提示rs2043211可能是中國人大動脈粥樣硬化性腦卒中的一種新型生物標(biāo)志物。Bai等［27］研究發(fā)現(xiàn)，9p21位點(diǎn)上的非編碼RNA ANRIL可能通過調(diào)節(jié)CARD8通路增加缺血性卒中的風(fēng)險。CARD8在缺血性卒中發(fā)病機(jī)制中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

4.4 免疫信號適配器（Bcl10） Bcl10最初是在黏膜相關(guān)淋巴組織的B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的染色體易位t（1； 14）（p22； q32）附近的候選基因，是一種細(xì)胞內(nèi)信號蛋白［28］。Bcl10收到刺激信號后形成細(xì)絲并聚集成介導(dǎo)和傳遞信號的高級簇，最終激活MALT1并傳導(dǎo)NF-κB和JNK信號。Bcl10在大鼠皮質(zhì)局灶性光栓4 h后的缺血半暗帶區(qū)表達(dá)升高了60%［29］。在一項(xiàng)基于多加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）和單細(xì)胞分析的研究中Bcl10被鑒定為缺血性卒中相關(guān)的關(guān)鍵基因［30］。Bcl10在缺血性卒中中的研究較少，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4.5 Caspase Caspase家族在程序性死亡和炎癥中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-1、Caspase-2、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-9、Caspase-12包含CARD結(jié)構(gòu)域。Caspase根據(jù)其功能分為凋亡型和炎癥型。凋亡型Caspase可進(jìn)一步分為啟動型和效應(yīng)型。Caspase-2、Caspase-9屬于啟動型，作為蛋白水解信號放大器激活效應(yīng)型Caspase。Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-12屬于炎癥型，激活細(xì)胞焦亡，觸發(fā)DAMPs的激活和分泌以促進(jìn)炎癥［31］。

缺血性卒中后Caspase的表達(dá)受到嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在大鼠MCAO造模12 h后Caspase-2則維持相對穩(wěn)定的水平［32］。Caspase-2基因敲除并不影響永久性局灶性缺血后的神經(jīng)功能缺損和組織損傷，在小鼠短暫性和永久性動脈閉塞后pro-Caspase-2的量保持不變，表明Caspase-2不是腦缺血導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要效應(yīng)物［33］。然而，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠MCAO和小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a的氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型中Caspase-2蛋白表達(dá)升高［34］。這可能與造模條件有關(guān)，也提示Caspase-2經(jīng)歷復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

Caspase-1被NLRP3/PYCARD激活后可以引發(fā)細(xì)胞焦亡。抑制Caspase-1可MCAO以通過抑制焦亡和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)/MAPK通路顯著改善大鼠缺血性卒中后血腦屏障的通透性和完整性［35］。

Caspase-4通過激活非規(guī)范的炎癥小體、NLRP3炎癥小體以及與TRAF6-IRAK1（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6-IL-1R-associated kinase 1）復(fù)合物的相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞焦亡、IL-1β的活化和分泌以及NF-κB炎癥通路［36］。

在大鼠MCAO模型中，Caspase-9在再灌注1 h就已經(jīng)被激活，神經(jīng)元活化的Caspase-9激活Caspase-6介導(dǎo)缺血性卒中后12 h內(nèi)的軸突丟失和24 h內(nèi)的神經(jīng)元死亡，在再灌注后4 h通過鼻內(nèi)遞送一種新型細(xì)胞膜穿透的高特異性Caspase-9抑制劑可以在缺血后3周持續(xù)提供神經(jīng)保護(hù)作用［37］。研究發(fā)現(xiàn)多種中藥復(fù)方和中草藥提取物，如木香油方、大黃堿、冬凌草素，可以改善Caspase-9介導(dǎo)的缺血性卒中后的細(xì)胞凋亡［38-40］。

Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的核心參與者。激活的Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位到胞質(zhì)，直接裂解Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3［41］。Mouw等［42］研究發(fā)現(xiàn)Caspase-12在MCAO后的紋狀體和大腦皮質(zhì)中顯著升高。重組IL-17A還可以通過Caspase-12依賴性途徑加劇缺血性卒中小鼠的神經(jīng)元凋亡［43］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪（OGD）處理后出現(xiàn)細(xì)胞損傷和凋亡的增加，Caspase-12、裂解的Caspase-3、NLRP3炎癥小體成分和IL-1β的蛋白水平也顯著升高；使用Caspase-12特異性抑制劑ZATAD-FMK預(yù)處理可以保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并抑制NLRP3炎癥小體的激活［41］。Caspase-12及其對NLRP3炎癥小體激活的調(diào)節(jié)可能是治療缺血性卒中的潛在靶點(diǎn)，具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

5 CARD-only proteins

COPs是Caspase-1和炎癥小體NLR家族激活的調(diào)節(jié)因子［44］。CARD18與含有CARD的激酶RICK/RIP2/CARDIAK相互作用并激活NF-κB［45］。CARD16、CARD17和CARD18通過競爭性結(jié)合并取代Caspase-1蛋白之間的CARD相互作用，改善尿酸晶體介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化和炎癥性疾?。?6］。研究發(fā)現(xiàn)抑制ICE可以減少缺血性和興奮性毒性神經(jīng)元損傷［47］。ICE突變能夠改善缺血誘導(dǎo)的腦損傷程度并保留神經(jīng)功能［48］。COPs在缺血性卒中中的作用有待進(jìn)一步研究。

6 其他CARD

CARD6是NF-κB活化的調(diào)節(jié)因子，通過協(xié)同RIPK家族調(diào)節(jié)NF-κB的活化［49］。在一項(xiàng)基于WGCNA和機(jī)器學(xué)習(xí)鑒定缺血性卒中患者外周血中的免疫相關(guān)關(guān)鍵基因的研究中，CARD6被認(rèn)為是缺血性卒中相關(guān)的樞紐基因。CARD6與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，與幼稚B細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)［50］。

7 小結(jié)

CARD蛋白家族參與細(xì)胞炎癥和凋亡，在缺血性卒中的病理過程中發(fā)揮重要作用，相關(guān)蛋白的突變也與缺血性卒中發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。目前有關(guān)CARD蛋白家族在腦缺血中的研究不斷出現(xiàn)，為靶向相關(guān)通路的治療提供基礎(chǔ)。本文歸納CARD蛋白在缺血性腦損傷中的研究（見表1）。目前，CARD蛋白家族的研究主要關(guān)注MAPK和NF-κB等信號通路，我們希望能更進(jìn)一步地研究CARD蛋白家族各個成員的功能和具體的調(diào)控機(jī)制，為臨床轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)新的策略和藥物靶點(diǎn)提供可能性。

表1 CARD蛋白在缺血性腦損傷中的研究

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡玉潔負(fù)責(zé)文獻(xiàn)收集、撰寫論文，徐運(yùn)負(fù)責(zé)擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。