呂志峰王 洋呂 楠任偉東李夢(mèng)杰 周友龍方 潔

（1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，鄭州 450000；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000；3河南中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000）

術(shù)后疼痛嚴(yán)重影響病人術(shù)后康復(fù)，其中10%～50%的病人可由急性疼痛逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁蕴弁?，?yán)重影響病人的精神狀態(tài)和生活質(zhì)量[1]。隨著舒適化醫(yī)療和加速康復(fù)外科理念的提出，如何安全有效緩解術(shù)后疼痛成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)。臨床鎮(zhèn)痛藥物包括非甾體抗炎藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥、局部麻醉藥等，但這些鎮(zhèn)痛藥物可引發(fā)諸多不良反應(yīng)，如藥物耐受、藥物依賴、胃腸功能以及認(rèn)知功能障礙等[2]。電針療法以穴位針灸為基礎(chǔ)，結(jié)合電流刺激，通過(guò)抑制疼痛信號(hào)傳遞、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放、改善免疫細(xì)胞功能等方式發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用[3]。然而，電針具體通過(guò)何種途徑發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用目前尚未完全明確。

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray, PAG)是傷害性刺激的中繼站，向上傳遞痛覺信息，向下調(diào)控疼痛反應(yīng)。研究表明，其功能與PAG 釋放的神經(jīng)遞質(zhì)及表達(dá)的蛋白關(guān)系密切，包括5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、c-Fos 蛋白、5-HT7受體(5-HT7R)等[4]。c-Fos 是一種原癌基因，又被稱為即刻早期反應(yīng)基因，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激后，誘導(dǎo)神經(jīng)元活性增加，c-Fos 蛋白表達(dá)明顯升高，因此炎癥因子c-Fos 蛋白通常被認(rèn)為是神經(jīng)元活性的標(biāo)記蛋白[5]。5-HT 是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，具有傳遞痛覺信息、調(diào)節(jié)體溫、睡眠等功能。研究發(fā)現(xiàn)，其生理作用取決于作用受體亞型和作用部位[6]。5-HT7R 是5-HT 受體家族中最后發(fā)現(xiàn)的受體亞型，廣泛存在于背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角、PAG 等部位，表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜，參與情緒、學(xué)習(xí)記憶以及疼痛等功能調(diào)節(jié)[7]。因此我們推測(cè)電針鎮(zhèn)痛可能與PAG 中5-HT7R的表達(dá)有關(guān)。

Brennan法是目前較成熟的術(shù)后急性疼痛模型，足趾部組織損傷使炎癥介質(zhì)及致痛因子釋放增加，從而引起手術(shù)區(qū)域異位痛和痛覺敏感[8]。“環(huán)跳”穴和“足三里”穴分別是足少陽(yáng)膽經(jīng)和足陽(yáng)明胃經(jīng)的重要腧穴，針灸兩穴均可達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、改善氣血、調(diào)節(jié)肢體功能之效[9]。因此，本研究通過(guò)重復(fù)電針預(yù)處理“足三里”和“環(huán)跳”穴，觀察足趾部切口痛大鼠的行為學(xué)變化、腦脊液中5-HT 水平、PAG 中c-Fos 蛋白和5-HT7R 表達(dá)，探討電針預(yù)處理緩解術(shù)后痛覺敏感的可能作用機(jī)制，為臨床鎮(zhèn)痛提供新思路、新方法。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本研究選擇SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，7～10周齡，體重220～350 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (京)2019-0008）。該實(shí)驗(yàn)已通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)：DWLL202108007）。

大鼠在溫度22℃ ～24℃、濕度50%～60%、12 h/12 h 晝夜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由飲食水。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均等分為四組(n= 10)：對(duì)照組（Con 組，既不電針刺激也不造切口痛）；切口痛模型組（IP 組，僅造切口疼痛模型）；正常+電針預(yù)處理組（Con + EA 組，僅行電針預(yù)處理）；模型+電針預(yù)處理組（IP + EA 組，造切口痛模型+電針預(yù)處理）。

2.主要儀器及試劑

華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，SDZ-V 型），智能熱板儀（合肥必海微軟件科技有限公司，ZH-YLS-6BS），vonFrey 纖維絲（Danmic Global 公司，37450-275），華佗牌一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，222104），正置熒光顯微鏡（日本尼康），5-HT 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（Elabscience，E-EL-0033c），兔抗5-HT7R 抗體（Immunoway 公司，YT4409），兔抗c-Fos 抗體（Immunoway 公司，YT0884），R-PE 偶聯(lián)山羊抗兔IgG（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，SA00008-2）。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）電針預(yù)處理：造模前，用大鼠固定器對(duì)大鼠加以固定，參照大鼠穴位圖譜，電針刺激Con + EA組和IP + EA 組大鼠右側(cè)“足三里”和“環(huán)跳”穴（頻率為2/10 Hz 的疏密波，刺激強(qiáng)度數(shù)值為1 檔，每日1 次30 min），以大鼠右后肢隨著電針頻率輕微抖動(dòng)作為電針刺激有效的標(biāo)志，每日1 次，同一時(shí)間點(diǎn)連續(xù)刺激5 天。

（2）足趾部切口痛大鼠模型：最后一次電針刺激24 h 后，2%異氟烷吸入麻醉大鼠，常規(guī)消毒，按Brennan 法建立足趾部切口痛模型：沿大鼠趾部方向，在大鼠右足跟近端0.5 cm 處劃一縱行切口，長(zhǎng)度約1 cm，劃開皮膚、皮下筋膜，暴露肌肉，用鑷子分離并挑起肌肉，棉簽按壓止血，規(guī)范縫合皮膚，術(shù)后碘伏消毒并涂抹紅霉素軟膏。

（3）機(jī)械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)測(cè)定：分別在第1 次電針預(yù)處理前2 h (T1)、術(shù)前2 h (T2)、術(shù)后4 h (T3)、術(shù)后24 h (T4)時(shí)測(cè)定MWT，采用標(biāo)準(zhǔn)化的vonFrey 纖維針刺激大鼠右后趾部切口附近區(qū)域，當(dāng)纖維絲彎曲為S 形，持續(xù)6～8 s，觀察大鼠縮足反應(yīng)。選取0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g、15 g 這10 根纖維絲，參照up-and-down 法，首先選取2.0 g 均勻緩慢用力，當(dāng)大鼠右足出現(xiàn)躲閃、抬起或舔咬，用“X”表示，接下來(lái)選擇低一等級(jí)的纖維絲；否用“O”表示，接著選高一等級(jí)的纖維絲。當(dāng)首次出現(xiàn)“XO”或“OX”時(shí)，再繼續(xù)測(cè)試4 次，并記錄最后一次使用的纖維絲強(qiáng)度，計(jì)算50%機(jī)械縮足閾值。若實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)0.4 g 仍有陽(yáng)性反應(yīng)或15 g仍為陰性反應(yīng)，則刺激強(qiáng)度為0.4 g 或15 g。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量3 次，每次間隔5 min，取其平均值。50%機(jī)械縮足閾值= (10[Xf+kδ])/10000（Xf 為最后一次使用的纖維針的log 值；k 為不同序列對(duì)應(yīng)值；δ 為所用刺激強(qiáng)度的log 值均差，此處約為0.174）。

（4）熱痛閾值測(cè)定：使用智能熱板儀測(cè)定大鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。設(shè)置熱板儀溫度為52℃±0.2℃，達(dá)到溫度后將其右后足貼于熱板，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，當(dāng)大鼠有明顯逃避動(dòng)作時(shí)記時(shí)結(jié)束，終止時(shí)間為30 s。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量3 次，每次間隔15 min，取其平均值，測(cè)定時(shí)間點(diǎn)與MWT 時(shí)間點(diǎn)一致。

（5）腦脊液提?。涸谧詈笠淮涡袨閷W(xué)測(cè)試后，用2%異氟烷將大鼠麻醉后固定至合適狀態(tài)，剃去頭背部毛發(fā)，切開皮膚，找到枕骨隆凸解剖位置，用1 ml 注射器滑至枕骨大孔后，針尖斜面向上，與頭部保持135°緩慢進(jìn)針，待感受到明顯的落空感時(shí)，停止進(jìn)針，緩慢抽取腦脊液。后續(xù)將腦脊液置入4℃低溫高速離心機(jī)進(jìn)行離心，2500 rpm/min、20 min，取上清液至液氮速凍后于-80℃冰箱凍存。

（6）灌注、固定、取材：抽取腦脊液完成后，將大鼠改為仰臥位，切開皮膚、胸骨，暴露心臟，針頭經(jīng)左心室進(jìn)入升主動(dòng)脈，剪開右心耳，依次推注0.9%氯化鈉注射液及4%多聚甲醛固定液進(jìn)行心臟灌注。灌注完畢后剪開頭部皮膚，打開顱骨，取出腦組織，置于4%多聚甲醛固定液中待測(cè)。

（7）酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)：依據(jù) ELISA 說(shuō)明，先后加入腦脊液及生物素標(biāo)記抗體進(jìn)行反應(yīng)，隨后磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)，洗去未結(jié)合物質(zhì)，加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)復(fù)合物，再次洗滌后依次加入3, 3',5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺(3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine,TMB)顯色液及終止液，在450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)樣本吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算5-HT 含量。

（8）免疫組化及免疫熒光：取固定的腦組織標(biāo)本，洗滌脫水后石蠟包埋制備切片，脫蠟消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶影響后蒸餾水清洗，PBS 浸泡，正常血清封閉非特異性位點(diǎn)后，加入c-Fos 或5-HT7R 抗體工作液，過(guò)夜孵育，PBS 沖洗后加入二抗，后續(xù)進(jìn)行顯色、復(fù)染、脫水、透明、制片等步驟，置于顯微鏡觀察拍照，使用Image J 軟件分析結(jié)果。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組或三組以上比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.電針預(yù)處理對(duì)切口痛大鼠MWT 影響

四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MWT 比較見圖1。在T1、T2時(shí)間點(diǎn)，四組大鼠兩兩相比，MWT均無(wú)明顯差異。T3、T4 時(shí)間點(diǎn)，與Con 組相比，IP 組痛閾值顯著降低(P＜ 0.01)；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠的痛閾值明顯升高(P＜ 0.05)。表明電針預(yù)處理可提高切口痛大鼠MWT，緩解機(jī)械性痛覺敏感。

圖1 四組大鼠四個(gè)時(shí)間點(diǎn)MWT 比較(n = 10,±SD)**P ＜ 0.01，與Con 組相比；#P ＜ 0.05，與IP 組相比Fig.1 Comparison of MWT at four time points in each group of rats (n = 10,±SD)**P ＜ 0.01, compared with group Con; #P ＜ 0.05,compared with group IP.

2.電針預(yù)處理對(duì)切口痛大鼠TWL 影響

四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TWL 比較見圖2。在T1、T2 時(shí)間點(diǎn)，四組大鼠兩兩相比，TWL 均無(wú)明顯差異。T3、T4 時(shí)間點(diǎn)，與Con 組相比，IP 組痛閾值明顯降低(P＜ 0.05)；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠痛閾值顯著升高(P＜ 0.01)。表明電針預(yù)處理可提高切口痛大鼠TWL，緩解熱痛覺敏感。

圖2 四組大鼠四個(gè)時(shí)間點(diǎn)TWL比較(n= 10,±SD)*P＜ 0.05，與Con組相比； ##P＜ 0.01，與IP 組相比Fig.2 Comparison of TWL at four time points in each group of rats(n=10,x±SD)*P＜ 0.05,comparedwith group Con; ##P ＜ 0.01,compared with group IP.

3.電針預(yù)處理對(duì)切口痛大鼠腦脊液中5-HT 表達(dá)影響

ELISA 法檢測(cè)四組大鼠腦脊液中5-HT 濃度含量，結(jié)果見圖3。與Con 組相比，IP 組和IP + EA組大鼠腦脊液中5-HT 的濃度均顯著升高(P＜ 0.01)，Con + EA 組腦脊液中5-HT 的濃度高于Con 組(P＜0.05)；其余各組兩兩相比，均無(wú)顯著性差異。

圖3 四組大鼠腦脊液中5-HT 濃度比較(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與Con 組相比Fig.3 Comparison of 5-HT concentrations in cerebrospinal fluid of rats (n = 3,±SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Con.

4.電針預(yù)處理對(duì)切口痛大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達(dá)影響

四組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白免疫組化見圖4。與Con 組相比，IP 組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達(dá)顯著增多(P＜ 0.01)；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白明顯減少(P＜ 0.05)；其余兩兩相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖5）。表明在疼痛狀態(tài)下，機(jī)體c-Fos 蛋白合成明顯增加，而電針預(yù)處理可減少切口痛大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達(dá)。

圖4 四組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達(dá)黑色箭頭指向c-Fos 蛋白，標(biāo)尺= 50 μm，放大倍數(shù)×400Fig.4 Expression of c-Fos protein in the PAG of rats The black arrows indicate c-Fos protein.Scale bar =50 μm, magnification ×400.

圖5 四組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白含量比較(n = 3,±SD)#**P ＜ 0.01，與Con 組相比；P ＜ 0.05，與IP 組相比Fig.5 Comparison of c-Fos protein content in the PAG of rats (n = 3,±SD)**P ＜ 0.01, compared with group Con；#P ＜ 0.05,compared with group IP.

5.電針預(yù)處理對(duì)切口痛大鼠PAG 中5-HT7R 表達(dá)影響

四組大鼠PAG 中5-HT7R 免疫熒光見圖6。與Con 組相比，Con + EA 組、IP 組、IP + EA 組PAG中5-HT7R 的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜ 0.05)；與IP 組相比，IP + EA 組PAG 中5-HT7R 的表達(dá)明顯增多（P＜ 0.05，見圖7），表明電針預(yù)處理可上調(diào)切口痛大鼠PAG中5-HT7R 表達(dá)。

圖6 四組大鼠PAG 中5-HT7R 蛋白表達(dá)白色箭頭指向5-HT7R 蛋白，標(biāo)尺 = 50 μm，放大倍數(shù) ×400Fig.6 Expression of 5-HT7R protein in the PAG of rats The white arrows indicate 5-HT7R protein, Scale bar =50 μm, magnification ×400.

圖7 四組大鼠PAG 中5-HT7R 蛋白含量比較(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與Con 組相比；#P ＜ 0.05，與IP 組相比Fig.7 Comparison of 5-HT7R protein content in PAG of rats(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Con;#P ＜ 0.05, compared with group IP.

討 論

電針刺激是一種物理療法，不良反應(yīng)小、無(wú)依賴性，對(duì)疼痛的預(yù)防性治療療效顯著。研究發(fā)現(xiàn)，在足底切口痛大鼠模型中分別用電針和嗎啡進(jìn)行多次干預(yù)，電針和嗎啡均可通過(guò)激活阿片類受體，抑制脊髓背角處c-Fos 蛋白表達(dá)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；但多次嗎啡注射出現(xiàn)耐藥性，而重復(fù)電針治療可使鎮(zhèn)痛效應(yīng)累積[10]。研究證實(shí)，在適量情況下重復(fù)電針刺激可抑制脊髓內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化，促進(jìn)腦干區(qū)域部分神經(jīng)元興奮，合成釋放多種鎮(zhèn)痛物質(zhì)，重構(gòu)突觸結(jié)構(gòu)，繼而實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛效應(yīng)的累積[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，不同頻率電針鎮(zhèn)痛效果不同，這也說(shuō)明電針鎮(zhèn)痛存在優(yōu)勢(shì)頻率或優(yōu)勢(shì)波[12]。相關(guān)臨床研究證實(shí)在術(shù)后疼痛中，疏密波鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于連續(xù)波，因此本研究以重復(fù)電針預(yù)處理為干預(yù)手段，選取2/10 Hz 疏密波，刺激強(qiáng)度數(shù)值為1 檔，每日1 次30 min，連續(xù)刺激5 天，以達(dá)到累積鎮(zhèn)痛效果。通過(guò)測(cè)定大鼠的MWT 和TWL 觀察其行為學(xué)變化，在T3、T4 時(shí)間點(diǎn)，與Con 組相比，IP 組大鼠的MWT 和TWL 均明顯降低；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠痛閾值明顯升高，說(shuō)明電針干預(yù)具有鎮(zhèn)痛效果，可明顯改善術(shù)后疼痛引起的痛覺敏化現(xiàn)象。

正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞中很少有c-Fos 蛋白表達(dá)，在受到外界刺激后，短期內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元活化，機(jī)體內(nèi)c-Fos 基因被迅速激活，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成c-Fos 蛋白。c-Fos 蛋白參與機(jī)體多種生理活動(dòng)，包括大腦發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶、細(xì)胞增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和疼痛調(diào)控等[13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在偏頭痛大鼠模型中PAG 內(nèi)c-Fos 蛋白顯著升高，而電針預(yù)處理可明顯減少c-Fos 蛋白表達(dá)[14]。本研究中，通過(guò)免疫組化檢測(cè)各組大鼠術(shù)后24 h 時(shí)PAG 中c-Fos 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與Con 組相比，IP 組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達(dá)顯著上升；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠的c-Fos 蛋白表達(dá)有所下調(diào)，這與大鼠痛閾值變化相一致，顯示電針預(yù)處理可下調(diào)大鼠PAG中c-Fos 蛋白，緩解術(shù)后疼痛引起的痛覺敏感現(xiàn)象。

研究表明在疼痛模型中，中樞核團(tuán)和腦脊液內(nèi)5-HT 含量明顯增加，這說(shuō)明機(jī)體可自主合成釋放5-HT 來(lái)對(duì)抗疼痛[15]。然而，5-HT 對(duì)疼痛調(diào)節(jié)作用取決于其所處部位、作用受體亞型、疼痛模型等，并不是單一高濃度抑痛、低濃度促痛或者外周促痛、中樞鎮(zhèn)痛[6]。Brenchat 等[16]發(fā)現(xiàn)在疼痛過(guò)程中PAG 內(nèi)的5-HT7R 表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明疼痛刺激可以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元表達(dá)5-HT7R。而應(yīng)用5-HT7R 激動(dòng)劑可以提高機(jī)體痛閾值，緩解疼痛[17]。本研究中，與Con 組相比，Con + EA 組、IP 組和IP + EA 組5-HT 及5-HT7R 表達(dá)均有所升高，其中IP + EA 組5-HT7R 活化程度更顯著。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他研究結(jié)果一致。切口痛可增加機(jī)體腦脊液中5-HT 濃度和PAG 中5-HT7R 蛋白表達(dá)，電針可上調(diào)PAG 中5-HT7R 的表達(dá)，這也說(shuō)明電針預(yù)處理可能通過(guò)5-HT7R 抑制疼痛信號(hào)的傳遞從而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用。然而本研究?jī)H提出了一種電針鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制，要明確這一鎮(zhèn)痛機(jī)制，還需加入5-HT7R拮抗劑或激動(dòng)劑來(lái)進(jìn)一步行分子生物學(xué)驗(yàn)證；同時(shí)，對(duì)電針干預(yù)緩解術(shù)后痛覺敏感的最佳時(shí)機(jī)、最優(yōu)方式也需進(jìn)行探尋比較。

綜上所述，切口痛大鼠手術(shù)區(qū)域可發(fā)生痛覺敏感，而電針預(yù)處理可明顯提高切口痛大鼠MWT 和TWL，降低PAG 中c-Fos 蛋白表達(dá)，改善大鼠痛覺敏感現(xiàn)象。其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與上調(diào)PAG 中5-HT7R蛋白表達(dá)有關(guān)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。