肖彤,夏育民,肖生祥

［作者單位］西安交通大學第二附屬醫(yī)院皮膚科,陜西 西安 710004

創(chuàng)傷愈合是一系列復雜且有序的過程,主要包括炎癥期、生長期和重塑期[1]。表皮的再上皮化是創(chuàng)傷愈合標志,表皮干細胞的參與在其中發(fā)揮重要作用[2]。在表皮中,干細胞(stem cell,SC)散在分布于基底層,而定向分化的祖細胞(committed progenitor,CP)分布于基底層和基底上層。

表皮干細胞主要有3種分裂方式:①對稱性自我更新(symmetric self-renewal,SSR),即一個干細胞分裂為兩個干細胞;②非對稱性自我更新(asymmetric self-renewal,ASR),即一個干細胞分裂為一個干細胞和一個分化的角質形成細胞;③對稱性分化(symmetric differentiation,SD),即一個干細胞直接分裂分化成為兩個角質形成細胞[3]。而定向祖細胞僅可進一步對稱性分化為分化程度更高的角質形成細胞(圖1b)。針對小鼠尾部皮膚創(chuàng)傷愈合的研究證實,表皮干細胞以非對稱分裂為主,穩(wěn)定持續(xù)地為表皮再上皮化提供細胞來源以及促進表皮的復層化[4]。

Sample pictures of wound healing in mice(n=3);Change of wound area;Estimated wound healing time

感覺神經(jīng)缺失可導致皮膚創(chuàng)傷愈合延遲[5],例如由辣椒素(capsaicin)誘導的感覺缺失可損害創(chuàng)傷中毛囊隆突區(qū)干細胞向表皮的遷移和增殖,從而阻礙創(chuàng)傷愈合[6]。辣椒素處理后實驗動物神經(jīng)元出現(xiàn)退行性變,神經(jīng)肽含量在下丘腦、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)及腎臟等組織中顯著降低[7-8]。相反,神經(jīng)肽,如血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和P物質(substance P,SP)等可促進創(chuàng)傷愈合[9-11]。

神經(jīng)肽在創(chuàng)傷愈合中的作用是否有表皮干細胞的參與及其參與方式仍不甚清楚。本研究通過觀察神經(jīng)肽P物質對小鼠皮膚厚度的影響,對創(chuàng)面愈合速度的影響,以及創(chuàng)面角質形成細胞增殖的方式等以期表明P物質可調控表皮干細胞的增殖方式促進損傷愈合。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 C57/BL6小鼠共36只,SPF級,雄性,6～8周齡,均購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心,體重約18～22 g,于該中心飼養(yǎng)處理。將小鼠隨機分為4組(9只/組),分別為PBS對照組(Control)、辣椒素處理組(Cap)、P物質處理組(SP)和辣椒素+P物質處理組(Cap+SP);進一步將4組小鼠分為非創(chuàng)傷組(3只/組)和創(chuàng)傷組(6只/組);創(chuàng)傷組又進一步分為拍照觀察組(3只/組)和細胞提取組(3只/組)。

1.2主要實驗儀器與試劑 熒光顯微鏡(Leica,DM4);熱敏甩尾測痛儀(Panlab,LE7106)。HE染色試劑盒(Solarbio,G1120);角蛋白1抗體(Novus Biologicals,NB100-2756);Numb抗體(Abcam,ab4147);DAPI抗熒光淬滅劑(Invitrogen,S36973);辣椒素(MCE,HY-10448,純度99.85%);P物質(MCE,HY-P0201,純度99.42%)。

1.3辣椒素處理小鼠 于創(chuàng)傷處理或取材前3周(75 mg/kg)及取材前2周(50 mg/kg)對實驗小鼠局部皮下注射辣椒素[12]。后對辣椒素處理組(包括Cap和Cap+SP組)及非辣椒素處理組(包括對照組和SP組)小鼠進行熱敏甩尾測痛鑒定,即鑒定小鼠尾部對熱刺激的反應時間,結果顯示辣椒素處理組較非辣椒素處理組反應時間顯著增長[(7.78±0.24)svs.(2.94±0.17)s,P<0.000 1]。

1.4P物質處理小鼠 于創(chuàng)傷處理或取材前10 d及創(chuàng)傷處理后14 d內,每2 d對實驗小鼠進行1次局部皮下注射,每個部位注射P物質10 nmol/kg,溶于PBS緩沖液中[13]。對照組于相同時間節(jié)點注射等量PBS。

1.5非創(chuàng)傷組小鼠取材及HE染色 取非創(chuàng)傷組小鼠注射局部皮膚組織置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋切片后,經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟復水后進行蘇木素及伊紅染色,中性樹脂封片。后續(xù)進行皮膚厚度及基底層細胞密度測定。

1.6創(chuàng)傷組小鼠取材及處理 于創(chuàng)傷組小鼠背部進行鉆孔處理為皮膚全層損傷,直徑為6 mm。部分小鼠每3 d進行拍照觀察直至創(chuàng)面愈合,后期對創(chuàng)面面積及愈合速度分析處理。其余小鼠于創(chuàng)傷后4 d取創(chuàng)傷周圍5 mm范圍內皮膚分離提取角質形成細胞,待細胞貼壁后進行細胞免疫熒光染色以分析細胞增殖分裂方式。

1.6.1角質形成細胞分離提取 獲得皮膚組織后依次經(jīng)75%酒精、5×雙抗HBSS清洗后,去除多余皮下組織,0.25%中性酶Dispase Ⅱ 4 ℃過夜處理以分離真表皮。次日剝離表皮組織后置于0.05%胰酶/EDTA中消化為單個細胞,以含10% FBS DMEM培養(yǎng)基中和胰酶,經(jīng)100 μm篩網(wǎng)過濾后收集細胞,于CNT-PR培養(yǎng)基重懸細胞后以20 000細胞/孔種于8室載玻片中。

1.6.2細胞免疫熒光染色 細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定,0.5% Triton裂解緩沖液通透處理后,以角蛋白1抗體(keratin 1,K1)和Numb抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h,清洗后分別以Alexa Flour 488和568熒光二抗室溫避光孵育1 h,最后以DAPI抗熒光淬滅劑封片。實驗結果應用Fiji軟件處理。

2 結果

2.1P物質促進創(chuàng)傷愈合 對每只小鼠創(chuàng)傷面積(mm2)(圖1a)和創(chuàng)傷后時間(d)進行線性回歸(圖1b),根據(jù)創(chuàng)傷初始面積(28.26 mm2)和線性回歸斜率可計算得出每組創(chuàng)傷愈合時間,并對4組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(表1,圖1c)。結果表明,與對照組相比,SP組加快創(chuàng)面愈合(P=0.056 1),Cap組則顯著減緩創(chuàng)面愈合(P<0.000 1);而與Cap組相比,Cap+SP組中神經(jīng)肽SP的加入顯著逆轉這一損傷(P<0.000 1)。結果顯示P物質對皮膚創(chuàng)傷愈合具有改善作用。

表1 不同組別小鼠的皮膚創(chuàng)傷愈合相關指標的檢測結果

2.2P物質增加表皮干細胞非對稱性自我更新 創(chuàng)傷后基底層細胞的增殖主要發(fā)生于創(chuàng)傷后第4天,且主要發(fā)生于創(chuàng)面周圍5 mm范圍內[4],因此本研究取相應部位皮膚提取角質形成細胞,以觀察創(chuàng)傷后細胞分裂方式。結果以每100個細胞中各類細胞分裂數(shù)量呈現(xiàn)(表1,圖2a)。結果表明,與對照組相比,SP組表皮干細胞非對稱自我更新顯著增加(P=0.000 3),Cap組則顯著減少表皮干細胞的非對稱自我更新(P=0.042 7);而與Cap組相比,Cap+SP 組中P物質的加入可顯著逆轉此作用(P=0.019)。相反,辣椒素和P物質對表皮干細胞的對稱性自我更新沒有明顯影響(P=0.12)。在細胞對稱性分化中,辣椒素和P物質作用趨勢和非對稱相似(圖2b)。因此,P物質主要通過增加表皮干細胞的非對稱自我更新以促進創(chuàng)傷愈合。

Note:SSR indicated symmetric self-renewal; ASR indicated asymmetric self-renewal; SD indicated symmetric differentiation.

2.3P物質可增加表皮厚度 對非創(chuàng)傷組的小鼠皮膚進行皮膚厚度測定(表1,圖3a)。結果表明,與對照組相比,P物質可顯著增加表皮厚度(P<0.000 1),辣椒素誘導的感覺缺失可明顯減少表皮厚度(P=0.001 9),小鼠表皮由正常的雙層細胞變?yōu)閱螌?而與Cap組相比,Cap+SP組中P物質的加入可幫助感覺缺失的表皮厚度恢復至接近正常(P=0.42)(圖3b)。相似的結果也出現(xiàn)在基底層細胞密度中,對每100 μm基底層的細胞數(shù)量進行測定,與對照組相比,辣椒素顯著減少基底層細胞密度(P<0.000 1),而P物質的加入可幫助恢復基底層細胞密度(P<0.000 1)。在感覺正常的皮膚中P物質并未進一步提高基底層細胞密度(P=0.34)(圖3c)。

Histopathological changes in epidermis(HE×100),scale bar=100μm;Comparison of epidermis thickness(n=3); Comparison of basal cell density per 100μm(n=3)

3 討論

本研究通過神經(jīng)肽P物質對正常感覺和感覺缺失小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的促進作用,發(fā)現(xiàn)其中表皮干細胞通過增加非對稱分裂促進細胞增殖,并在促進表皮復層化中發(fā)揮重要作用。

表皮干細胞的自我更新及分裂分化主要參與維持皮膚穩(wěn)態(tài)平衡,在皮膚缺損中負責提供細胞來源。干細胞3種分裂方式的平衡在生理狀態(tài)下至關重要,失衡狀態(tài)可能導致過度增殖疾病的發(fā)生,如銀屑病、皮膚腫瘤等。在銀屑病中,表皮干細胞以非對稱分裂為主,在基底層干細胞數(shù)量維持不變的情況下,顯著增加表皮的層數(shù)[15]。與之類似,干細胞非對稱分裂的增加可能參與小鼠炎癥性腸病的發(fā)生[16]。相反,對稱性分裂的顯著增加可增加干細胞的數(shù)量,并與腫瘤的發(fā)生有密切關系[17]。本研究發(fā)現(xiàn),P物質主要通過增加表皮干細胞非對稱分裂促進創(chuàng)傷皮膚再上皮化,而對稱性分化的增加可能為P物質對表皮干細胞的直接促進作用,也可能由于非對稱分裂后定向祖細胞數(shù)量增加,而導致定向祖細胞的對稱性分化增加;或二者同時存在。角蛋白1(keratin 1,K1)是一種角質形成細胞分化的標記,而Numb作為一種Notch抑制劑,被認為是細胞非對稱分裂的標記[14]。對稱性自我更新2個分裂細胞均不表達K1和Numb;對稱性分化2個分裂細胞均表達K1和Numb;而非對稱性自我更新后2個子細胞中僅有1個表達K1和Numb。據(jù)此,本實驗對創(chuàng)傷后細胞分裂的方式進行統(tǒng)計分析。本研究中由于K1/Numb標記無法區(qū)分對稱性分化的母細胞來源,因此無法對此現(xiàn)象做出準確判斷。由于非對稱性分裂的增加,小鼠表皮分層增加,表皮厚度有明顯改變。而基底層細胞數(shù)量達到飽和后,細胞可繼續(xù)向棘層遷移分化。

臨床中常見糖尿病患者創(chuàng)傷愈合延遲,主要與周圍神經(jīng)受損缺失、微血管功能受損、感染和免疫異常有關。嚴重者可見糖尿病潰瘍、糖尿病足并有截肢致殘可能[18]。神經(jīng)肽在創(chuàng)傷愈合過程中作用機制復雜,可能與其調節(jié)炎癥因子如白介素6、白介素8、腫瘤壞死因子α等有關。P物質作為神經(jīng)肽的重要成員,可能通過調節(jié)創(chuàng)傷初期炎癥反應、促進巨噬細胞型別轉換等促進創(chuàng)傷愈合[19-20]。本研究進一步證明,P物質對創(chuàng)傷愈合的促進作用除對炎癥期的調節(jié)之外,其對細胞增生期尤其是對表皮干細胞的非對稱分裂方式有明顯促進作用,從而促進表皮的再上皮化,加速創(chuàng)傷愈合。

綜上,本研究通過對神經(jīng)肽P物質對表皮干細胞分裂方式的調節(jié)作用發(fā)現(xiàn),P物質可通過增加表皮干細胞的非對稱分裂促進表皮再上皮化,進一步為P物質在創(chuàng)傷愈合細胞增生期的調節(jié)作用提供理論基礎。