姬倩悅，馬敏，彭鑫，賈辰熙，李靈軍,3

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基于質(zhì)譜技術(shù)的神經(jīng)肽研究進(jìn)展

姬倩悅1,2，馬敏1,2，彭鑫1，賈辰熙2，李靈軍1,3

1 天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072 2 國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心北京蛋白質(zhì)組研究中心蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 102206 3 美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校藥學(xué)院和化學(xué)系，美國(guó)威斯康星麥迪遜 53705

姬倩悅, 馬敏, 彭鑫, 等. 基于質(zhì)譜技術(shù)的神經(jīng)肽研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1061–1068.Ji QY, Ma M, Peng X, et al. Advances in mass spectrometry-based approaches for neuropeptide analysis. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1061–1068.

神經(jīng)肽是一類重要的內(nèi)源活性物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，并連接大腦和其他神經(jīng)器官?；谫|(zhì)譜技術(shù)的神經(jīng)肽組學(xué)研究旨在對(duì)神經(jīng)肽進(jìn)行大規(guī)模研究，在分子水平上得到重要信息，進(jìn)一步加深對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制以及神經(jīng)疾病致病機(jī)理的理解。文中綜述了利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)肽研究的基本策略，包括樣品處理、定性定量方法以及質(zhì)譜成像等研究進(jìn)展。

神經(jīng)肽，質(zhì)譜，定性，定量，質(zhì)譜成像

“神經(jīng)肽”最初是由De Wied[1]在1971年提出，是在神經(jīng)細(xì)胞中合成的內(nèi)源性肽段，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)來(lái)影響多種生理進(jìn)程，具有典型的多肽短鏈結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度一般為3–100個(gè)氨基酸。神經(jīng)肽的生理學(xué)功能主要是在神經(jīng)元以及其他細(xì)胞或靶器官之間傳遞信號(hào)。在臨床上，神經(jīng)肽扮演著重要角色。神經(jīng)肽的調(diào)節(jié)異常往往會(huì)引起一系列的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，精氨酸加壓素、腦啡肽、β-內(nèi)啡肽等神經(jīng)肽與癲癇的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，而膽囊收縮素和血管緊縮素可以抑制腦內(nèi)癲癇發(fā)作[2]。也有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽與皮膚免疫反應(yīng)、組織維護(hù)及修復(fù)有關(guān)[3]。因此，神經(jīng)肽以及神經(jīng)肽受體已經(jīng)成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物靶點(diǎn)[4]。

神經(jīng)肽是在神經(jīng)元中合成，首先合成神經(jīng)肽前體，然后經(jīng)過(guò)一系列酶切、翻譯后修飾等過(guò)程產(chǎn)生具有活性的神經(jīng)肽。一個(gè)神經(jīng)肽前體可以產(chǎn)生多個(gè)具有活性的神經(jīng)肽。即使是同一家族的神經(jīng)肽仍可能具有不同的功能，甚至?xí)鹣喾吹恼{(diào)節(jié)作用。因此，神經(jīng)肽的這些分子水平特性導(dǎo)致對(duì)其研究極其困難并具有很大的挑戰(zhàn)性。

傳統(tǒng)的研究神經(jīng)肽的方法主要是放射免疫法、免疫組織化學(xué)法、RNA印跡試驗(yàn)等。這些方法不僅需要耗費(fèi)大量時(shí)間，而且神經(jīng)肽必須有已知信息，因此不適用于發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)肽。此外，基于抗體的免疫化學(xué)法易發(fā)生交叉反應(yīng)，難以區(qū)分同一神經(jīng)肽的不同亞型[5]。

近年來(lái)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣。由于質(zhì)譜分析具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等特點(diǎn)，為神經(jīng)肽的研究提供了新途徑。在微量樣品中，質(zhì)譜儀可檢測(cè)出大量神經(jīng)肽，并可精確測(cè)量肽段的質(zhì)荷比 (mass/charge，/)，根據(jù)肽段的二級(jí)圖譜進(jìn)行從頭測(cè)序、同源序列比對(duì)等方法，從而發(fā)現(xiàn)新型未知的神經(jīng)肽。通過(guò)非標(biāo)記方法或者同位素標(biāo)記的方法，質(zhì)譜可以檢測(cè)神經(jīng)肽的動(dòng)態(tài)變化。此外，運(yùn)用質(zhì)譜成像技術(shù)可對(duì)神經(jīng)肽的分布提供具體信息。圖1概括了目前利用質(zhì)譜研究神經(jīng)肽的主要技術(shù)路線。

圖1 神經(jīng)肽研究的技術(shù)路線流程圖

1 樣品制備

質(zhì)譜是一種具有高靈敏度的分析儀器，若想對(duì)神經(jīng)肽進(jìn)行精確分析，則應(yīng)提高樣品的純度。在神經(jīng)肽檢測(cè)過(guò)程中，很多因素會(huì)對(duì)其分析造成一定的影響，例如高鹽、脂質(zhì)以及能引起神經(jīng)肽降解的酶等，均可抑制神經(jīng)肽的檢測(cè)信號(hào)，對(duì)分析結(jié)果造成影響。因此，需要采用特殊有效的樣品制備方法和策略。

當(dāng)動(dòng)物的腦部組織被解剖出后，蛋白酶就開(kāi)始快速降解蛋白質(zhì)以及神經(jīng)肽。相對(duì)豐度較高的蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物通常很復(fù)雜，抑制了組織中相對(duì)豐度較低的神經(jīng)肽的信號(hào)，對(duì)神經(jīng)肽的檢測(cè)造成困難。為了滅活組織中蛋白酶，常用的一種處理方法是對(duì)組織進(jìn)行微波加熱。Che 等[6]利用微波技術(shù)對(duì)小鼠的下丘腦和垂體進(jìn)行加熱，使其中蛋白酶迅速變性，并采用質(zhì)譜和穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法對(duì)神經(jīng)肽進(jìn)行定量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)微波加熱后，在下丘腦中檢測(cè)到的神經(jīng)肽含量比未經(jīng)此技術(shù)處理的樣品高出2–3倍。Sturm等[7]也利用微波加熱的方法處理下丘腦和紋狀體組織并且分析其中神經(jīng)肽。另一種常用處理方法是利用生物樣品穩(wěn)定儀——Denator[8]對(duì)樣品進(jìn)行處理。Sturm等[9]比較了利用生物樣品穩(wěn)定儀滅活蛋白酶的樣品和未滅活樣品的神經(jīng)肽數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在利用電噴霧電離源分析時(shí)，動(dòng)物死后的蛋白質(zhì)降解片段會(huì)掩蓋神經(jīng)肽信號(hào)，增加圖譜復(fù)雜性。此外，通過(guò)給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌注蛋白酶抑制劑的方法也可以有效抑制蛋白酶的降解作用[10]。使用這種方法處理樣品后，不僅可獲得更多的完整神經(jīng)肽數(shù)量，而且蛋白酶的降解產(chǎn)物也相應(yīng)地減少。

對(duì)于體液中的神經(jīng)肽，可以采用微透析技術(shù)與質(zhì)譜分析相結(jié)合，從而提高神經(jīng)肽的鑒定數(shù)量。微透析技術(shù) (Microdialysis，MD) 是一種利用膜透析原理對(duì)活體細(xì)胞外液中生化物質(zhì)進(jìn)行采集的技術(shù)。因?qū)?dòng)物造成的干擾小，且樣品不被非變量因素干擾，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)分析[11]。但是，使用微透析技術(shù)時(shí)，其神經(jīng)肽回收率低是阻礙其應(yīng)用的瓶頸，因?yàn)榕c其他小分子相比，神經(jīng)肽的尺寸較大，會(huì)堵塞透析膜，因此影響神經(jīng)肽的回收率。為了增加神經(jīng)肽的回收率，通常將親和劑加在液體灌注探頭中，分析物與親和劑結(jié)合，導(dǎo)致透析液中分析物濃度降低，增大濃度梯度，驅(qū)動(dòng)分析物透過(guò)透析膜，這種方法被稱為親和力增強(qiáng)微透析 (Affinity-enhanced microdialysis，AE-MD)[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用抗體、環(huán)糊精等親和劑，成功提高了細(xì)胞因子和神經(jīng)肽的回收率[13]。Schmerberg等[14]比較了C18硅膠顆粒、抗體包被的微粒等不同親和劑對(duì)神經(jīng)肽進(jìn)行富集，發(fā)現(xiàn)抗體包覆磁性納米顆粒 (AbMnP) 的效果最好，使神經(jīng)肽回收率增加超過(guò)40倍。利用此方法分析北黃道蟹神經(jīng)器官中的神經(jīng)肽，與常規(guī)方法相比檢測(cè)到更多的神經(jīng)肽，且蛋白質(zhì)降解碎片的數(shù)量也大大降低[15]。

2 質(zhì)譜分析

液相色譜與二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用是神經(jīng)肽分析強(qiáng)有力的工具，通常采用數(shù)據(jù)依賴采集方法對(duì)其進(jìn)行高通量分析。但是神經(jīng)肽的質(zhì)量大小多變，質(zhì)譜對(duì)大于4 kDa的肽段解離和裂解效果不佳，降低對(duì)中等或者質(zhì)量大的肽段從頭測(cè)序能力。根據(jù)神經(jīng)肽的質(zhì)量大小，分別采取不同的分析策略，可以精確鑒定到不同大小的神經(jīng)肽。如利用數(shù)據(jù)依賴采集串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)質(zhì)量小的神經(jīng)肽，自上而下(Top-down) 的測(cè)序方法檢測(cè)中等大小的神經(jīng)肽，自下而上(Bottom-up) 的方法分析質(zhì)量大的神經(jīng)肽，為神經(jīng)肽的全面研究提供新的思路[16]。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)非依賴采集方法是通過(guò)從頭測(cè)序的方法，不依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)，從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中按照質(zhì)譜二級(jí)數(shù)據(jù)中碎片離子信息直接推測(cè)序列，這對(duì)于發(fā)現(xiàn)新型未知神經(jīng)肽具有很大意義。Ye等[17]利用從頭測(cè)序的方法研究了加利福尼亞龍蝦中的神經(jīng)肽，通過(guò)從頭測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)34種神經(jīng)肽，包括18種新型神經(jīng)肽，并揭示了加利福尼亞龍蝦中向肌肽 (Orcokinin) 新型序列基序。

利用兩種質(zhì)譜技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離-傅里葉變換質(zhì)譜 (MALDI-FTMS)和納流液相色譜-電噴霧電離-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜 (Nano LC-ESI-Q-TOF MS/MS)，Ma等[18]將生物質(zhì)譜分析和功能基因組分析結(jié)合，共同驗(yàn)證神經(jīng)肽的功能。MALDI-FTMS用來(lái)檢測(cè)已知神經(jīng)肽的精確質(zhì)量，而nano LC-ESI-Q-TOF MS/MS用來(lái)對(duì)未知的神經(jīng)肽進(jìn)行從頭測(cè)序。此外，利用同源轉(zhuǎn)錄組信息搜索質(zhì)譜檢測(cè)到的神經(jīng)肽，驗(yàn)證了鞣化激素β亞型、蝗抗利尿肽等。而Hayakawa等[19]將碰撞誘導(dǎo)解離 (Collision-induced dissociation，CID) 和電子轉(zhuǎn)移解離(Electron transfer dissociation，ETD) 這兩種不同的離子碎裂方式結(jié)合，檢測(cè)小鼠垂體腫瘤細(xì)胞中的神經(jīng)肽。經(jīng)過(guò)結(jié)合不同的解離方法，使同一肽段產(chǎn)生不同的碎片離子，為神經(jīng)肽的鑒定提供更豐富的序列信息，從而提高鑒定可信度。

3 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜是一種高通量的分析儀器，一次實(shí)驗(yàn)可獲得海量數(shù)據(jù)，所以需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)處理手段從龐大的質(zhì)譜原始文件中鑒定、定量神經(jīng)肽。肽組學(xué)分析數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)組學(xué)的差別是不需要選擇酶切，采用非特異性數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí)，需要相應(yīng)種屬數(shù)據(jù)庫(kù)提供神經(jīng)肽名稱、序列等信息。蛋白質(zhì)前體數(shù)據(jù)庫(kù)可以從網(wǎng)站上下載，例如Uniprot、NCBI等。

為了減小假發(fā)現(xiàn)率，在研究神經(jīng)肽時(shí)，經(jīng)常應(yīng)用只含有潛在神經(jīng)肽序列或其前體蛋白序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，而不是選用該生物的全蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。神經(jīng)肽是由神經(jīng)肽前體經(jīng)酶切產(chǎn)生，所以許多研究者利用神經(jīng)肽的剪切規(guī)律預(yù)測(cè)神經(jīng)肽的序列，例如NeuroPred[20]是預(yù)測(cè)神經(jīng)肽前體裂解位點(diǎn)，提供肽段潛在序列。而SwePep數(shù)據(jù)庫(kù)中包含已經(jīng)被注釋的神經(jīng)肽，可以手工或者利用軟件直接與原始數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定神經(jīng)肽[21]。應(yīng)用選定的數(shù)據(jù)庫(kù)，利用搜庫(kù)軟件，例如Mascot、SEQUEST、PEAKS和ProSightPC等，通過(guò)肽段質(zhì)量對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將圖譜與含有理論肽段的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，得到圖譜對(duì)應(yīng)的肽段信息。

除了與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，還可以通過(guò)從頭測(cè)序的方法分析肽段，特別是在缺少相應(yīng)種屬的基因組序列時(shí)。在分析質(zhì)譜圖譜時(shí)，按照氨基酸的質(zhì)量推測(cè)出肽段序列，然后進(jìn)行序列同源比對(duì)，得到有相似序列的物種，根據(jù)其所屬的家族推測(cè)出該肽段可能具有的功能。從頭測(cè)序可以通過(guò)軟件輔助分析，例如PEAKS[22]。通過(guò)加入化學(xué)修飾可以幫助指認(rèn)多肽的碎片離子，使b離子和y離子在二級(jí)質(zhì)譜中分開(kāi)，例如還原甲基化標(biāo)記法等。這種方法標(biāo)記神經(jīng)肽的N末端和賴氨酸的ε氨基，標(biāo)記后每一個(gè)位點(diǎn)增加28 Da，且a1離子信號(hào)增強(qiáng)，有利于從頭測(cè)序分析[23]。同時(shí)，標(biāo)記后的肽段帶電狀態(tài)變化不大，不會(huì)降低肽段分析的精確度。

4 神經(jīng)肽的定量

利用質(zhì)譜技術(shù)可以測(cè)量不同情況下神經(jīng)肽的含量，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的高度重復(fù)性決定了定量的準(zhǔn)確性。對(duì)神經(jīng)肽的定量分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量，絕對(duì)定量是指獲得某種肽段的精確表達(dá)量，而相對(duì)定量則是通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)比較在不同條件下的樣品中肽段表達(dá)量的差異。定量的手段分為非標(biāo)記定量和穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量。非標(biāo)記定量通常是利用質(zhì)譜圖中峰面積、峰強(qiáng)度或者圖譜數(shù)量進(jìn)行定量，這不能準(zhǔn)確定量低豐度的神經(jīng)肽。Frese等[24]借助高分辨率的串聯(lián)質(zhì)譜，利用肽段的提取離子色譜圖 (Extracted ion chromatogram，XIC) 的峰面積，研究下丘腦和紋狀體中調(diào)控進(jìn)食的神經(jīng)肽。利用胰蛋白酶酶解的BSA肽段作為內(nèi)標(biāo)，在質(zhì)譜水平上對(duì)檢測(cè)技術(shù)的變化進(jìn)行歸一化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠進(jìn)食高糖高脂肪的食物時(shí)，促進(jìn)食欲神經(jīng)肽含量相對(duì)上調(diào)。Lee等[25]利用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)視交叉上核中神經(jīng)肽進(jìn)行研究，通過(guò)比較峰強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)肽含量具有顯著差異，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得到神經(jīng)肽調(diào)控大鼠的晝夜節(jié)律的證據(jù)，這為探索視交叉上核的晝夜節(jié)律功能提供了重要的分子水平信息。

利用化學(xué)或者代謝方法引入的穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行定量。利用標(biāo)記試劑，在肽段中引入同位素標(biāo)簽，不同樣品中同一肽段具有質(zhì)量差，在同一圖譜中分析峰強(qiáng)度，可以得到相關(guān)肽的比例。

研究者已發(fā)明可以進(jìn)行多標(biāo)定量的化學(xué)試劑，在不增加樣品復(fù)雜度的前提下增加標(biāo)記數(shù)量，例如TMT[26]、iTRAQ[27]、DiLeu[28]等方法。上文提到還原甲基化標(biāo)記法可以輔助從頭測(cè)序，除此之外，還可以被運(yùn)用于神經(jīng)肽的定量。為了研究與進(jìn)食相關(guān)的神經(jīng)肽，Chen等[11]利用甲醛和氘代甲醛分別標(biāo)記未進(jìn)食和進(jìn)食的動(dòng)物的神經(jīng)肽組，以1∶1的比例混合進(jìn)行質(zhì)譜分析，觀察質(zhì)譜圖譜可得到神經(jīng)肽的相對(duì)變化比例。結(jié)果表明，在進(jìn)食之后，CabTRP含量提高，而Pyrokinin含量降低。結(jié)合質(zhì)譜成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，嗅葉和中央前大腦是關(guān)于進(jìn)食的主要兩個(gè)區(qū)域。同樣，研究者用此方法研究了溫度對(duì)冷血生物神經(jīng)肽的影響，發(fā)現(xiàn)高溫時(shí)心包器官中的RFamide和RYamide含量顯著降低，而竇腺中的orcokinin含量降低[29]。

Hui等[30]研究藍(lán)蟹的神經(jīng)肽，結(jié)合從頭測(cè)序的方法，利用N,N-二甲基亮氨酸 (DiLeu) 對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，提高測(cè)序的準(zhǔn)確度。被標(biāo)記神經(jīng)肽的二級(jí)圖譜表現(xiàn)出高強(qiáng)度的指示離子 (/114)，可作為神經(jīng)肽檢測(cè)的標(biāo)簽。同時(shí)，DiLeu標(biāo)記可增強(qiáng)神經(jīng)肽在質(zhì)譜中的碎裂，有利于從頭測(cè)序。此研究鑒定了藍(lán)蟹11個(gè)家族的130種神經(jīng)肽，其中有44種是新發(fā)現(xiàn)的肽段。

代謝標(biāo)記是在肽段合成過(guò)程中引入同位素，即在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)引入同位素標(biāo)記的氨基酸或者在飼養(yǎng)動(dòng)物時(shí)喂食含有同位素的食物。細(xì)胞培養(yǎng)中使用氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定的同位素標(biāo)記 (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC) 方法是將含有重標(biāo)或者輕標(biāo)的必需氨基酸加入培養(yǎng)基中，并引入目標(biāo)細(xì)胞中，其所包含的蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶解后，會(huì)產(chǎn)生具有相應(yīng)質(zhì)量差的肽段。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)，因其較高的標(biāo)記率，而被廣泛使用[31]。但是，這種方法缺點(diǎn)是試劑較為昂貴，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，而且并不是每一種樣品都適用于此方法。此外，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)也可以將同位素引入肽段中，常用的標(biāo)記方法有四甲基溴化銨 (TMAB)、二甲基標(biāo)記[32]等。

以上方法是對(duì)神經(jīng)肽進(jìn)行相對(duì)定量，獲得不同樣品之間肽段表達(dá)差異。對(duì)于已知的神經(jīng)肽，可以采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Multiple reaction monitoring，MRM) 對(duì)肽段進(jìn)行絕對(duì)定量。MRM是根據(jù)待檢測(cè)離子的質(zhì)量信息，有選擇地收集二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，降低其他信號(hào)干擾。Kosanam等[33]采用MRM方法對(duì)大鼠腦部的α以及γ內(nèi)啡肽進(jìn)行定量，以測(cè)定其相對(duì)于組織的含量，其含量分別為 (13.8±0.57) ng/g和(2.5±0.43) ng/g。

5 質(zhì)譜成像技術(shù)

目前，利用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)神經(jīng)肽的研究主要集中于鑒定和定量，且神經(jīng)肽空間分布也為研究其功能提供重要信息。免疫組織化學(xué)染色可以研究神經(jīng)肽分布，但是提供的化學(xué)信息較少，并且抗體容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)而使結(jié)果不準(zhǔn)確。由Gessel等[34]發(fā)明的質(zhì)譜成像方法 (Mass spectrometric imaging，MSI) 可以克服以上問(wèn)題，在組織、細(xì)胞水平對(duì)待測(cè)分子的空間分布信息進(jìn)行成像，具有高敏感度和化學(xué)特異性。待測(cè)樣品被固定于含有-軸的樣品板上，通過(guò)質(zhì)譜電離技術(shù)獲得每個(gè)位點(diǎn)的質(zhì)荷比信息，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度得到相應(yīng)的熱點(diǎn)圖，從而顯示出組織樣品中生物分子的空間分布信息。

DeKeyser等[35]利用MALDI質(zhì)譜分子成像技術(shù)研究了北黃道蟹圍心器和腦部的神經(jīng)肽組成，鑒定了超過(guò)10個(gè)家族神經(jīng)肽的分布，發(fā)現(xiàn)同一家族的神經(jīng)肽也會(huì)呈現(xiàn)不同的分布信息。OuYang等[36]將質(zhì)譜成像與數(shù)據(jù)依賴采集方法相結(jié)合，利用MALDI-LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀研究甲殼類動(dòng)物的神經(jīng)肽。將全質(zhì)譜掃描與數(shù)據(jù)依賴采集掃描結(jié)合在一次質(zhì)譜分析中，使質(zhì)譜成像分析更加快速，且可同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)肽的鑒定和分布研究。最終實(shí)驗(yàn)原位鑒定到藍(lán)蟹的39種已知神經(jīng)肽及一種新型神經(jīng)肽。

但是，利用質(zhì)譜成像的方法研究神經(jīng)肽仍然存在諸多問(wèn)題。例如，在研究小分子時(shí)，基質(zhì)在激光照射時(shí)產(chǎn)生的基質(zhì)離子可能會(huì)掩蓋分析物離子的信號(hào)，特別是對(duì)于質(zhì)量小于500 Da的分子。Shariatgorji等[37]分析了D4-CHCA與CHCA，發(fā)現(xiàn)與CHCA相比，D4-CHCA的電離離子發(fā)生質(zhì)量偏移，低質(zhì)量分析物的質(zhì)譜峰不被基質(zhì)覆蓋。或者使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Selective reaction monitor，SRM)，只有特定的片段離子被檢測(cè)，因此基質(zhì)離子不會(huì)對(duì)分析物的檢測(cè)造成干擾[38]。利用質(zhì)譜成像進(jìn)行定量、樣品制備的重復(fù)性等問(wèn)題也是質(zhì)譜成像技術(shù)面臨的難題。

6 總結(jié)與展望

神經(jīng)肽是一種重要的信號(hào)分子，在眾多生理學(xué)過(guò)程中具有重要作用，也是藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。應(yīng)用基于質(zhì)譜的神經(jīng)肽組學(xué)技術(shù)，對(duì)神經(jīng)肽鑒定和定量，可為在不同的生理學(xué)進(jìn)程中神經(jīng)元之間信號(hào)傳遞與調(diào)控提供更加深刻的認(rèn)識(shí)。

隨著技術(shù)的發(fā)展，更加先進(jìn)的質(zhì)譜儀和技術(shù)被利用于多種樣品的研究。但是，眾多研究只是集中于鑒定到的神經(jīng)肽數(shù)目，而沒(méi)有對(duì)其生物功能進(jìn)行深入研究。例如，不能有效區(qū)分內(nèi)源性多肽和其前體的降解產(chǎn)物。一般方法是將檢測(cè)到的數(shù)據(jù)與神經(jīng)肽前體序列對(duì)比，確定是否存在神經(jīng)肽。但事實(shí)是檢測(cè)到的肽段通常是活性神經(jīng)肽的一部分，這些縮短形式的神經(jīng)肽并不能被確認(rèn)為獨(dú)立的神經(jīng)肽還是冗余。

即使近些年分析技術(shù)迅速發(fā)展，但新神經(jīng)肽功能的研究仍然進(jìn)程緩慢。這就需要開(kāi)發(fā)可靠的方法，對(duì)具有重要生物學(xué)功能的神經(jīng)肽進(jìn)行深入研究。當(dāng)前的定性和定量的方法，仍需簡(jiǎn)化流程、增加重現(xiàn)性，才能得到廣泛推廣和利用。為了從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中挖掘出更多的信息，生物信息學(xué)分析工具也需要進(jìn)一步改進(jìn)以適應(yīng)質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Advances in mass spectrometry-based approaches for neuropeptide analysis

Qianyue Ji1,2, Min Ma1,2, Xin Peng1, Chenxi Jia2, and Lingjun Li1,3

1,,300072,2,,,,102206,3,53705,

Neuropeptides are an important class of endogenous bioactive substances involved in the function of the nervous system, and connect the brain and other neural and peripheral organs. Mass spectrometry-based neuropeptidomics are designed to study neuropeptides in a large-scale manner and obtain important molecular information to further understand the mechanism of nervous system regulation and the pathogenesis of neurological diseases. This review summarizes the basic strategies for the study of neuropeptides using mass spectrometry, including sample preparation and processing, qualitative and quantitative methods, and mass spectrometry imagining.

neuropeptides, mass spectrometry, identification, quantitation, mass spectrometry imaging

December 25, 2016;Accepted: February 6, 2017

Lingjun Li. E-mail: lingjun.li@wisc.edu Chenxi Jia. E-mail: cjia@mail.ncpsb.org

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21675006), National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. SQ2016YFJC040033, 2016YFA0501302).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21675006)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (Nos. SQ2016YFJC040033, 2016YFA0501302) 資助。