程 林，袁 慊，王 瑜，馮 偉，孫鳳軍△，戴曉天

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.藥學(xué)部；2.呼吸科,重慶 400038)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流阻塞特征的肺氣腫和/或慢性支氣管炎，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且病死率較高。據(jù)WHO預(yù)測，到2030年，COPD將成為全球第3位導(dǎo)致死亡的疾病[1]。新近的一項研究結(jié)果顯示，在20歲以上的中國人群中，通過肺功能檢查確診的COPD整體患病率為8.6%，而40歲以上人群的患病率達13.7%[2]。目前COPD的治療難以取得滿意的療效，多以緩解癥狀、提高運動耐量和生活質(zhì)量、延緩疾病進展為目的。干細胞由于具有替代受損細胞的功能而被認(rèn)為具有治愈肺部疾病的潛力[3- 6]。

支氣管基底層細胞是位于支氣管上皮基底層的一類細胞，被認(rèn)為是肺內(nèi)的干細胞，這類細胞作為一個獨立的生命體，具有很強的生命力。它的分裂和遷移都比較活躍，能夠不斷產(chǎn)生新的細胞以補充死亡的其他類型上皮細胞，功能上具有可塑性，可以直接修復(fù)支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)。目前已證實支氣管基底層細胞移植可以直接修復(fù)實驗動物的受損肺臟[7- 9]。作者團隊前期研究顯示，通過支氣管鏡刷檢的方法，從人的3～5級支氣管中獲取微量組織分離提取的SOX9+支氣管基底層細胞，體外擴增后進行自體移植，具有修復(fù)慢性支氣管炎患者受損肺組織的功能[10- 11]。因此，作者團隊開展了一項自體支氣管基底層細胞移植治療COPD的小樣本探索性研究，初步評價自體支氣管基底層細胞治療COPD的安全性及有效性，為COPD患者的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年10月至2018年10月，共入組4例COPD患者，患者均為男性，年齡45～70歲，體質(zhì)量指數(shù) (21.5±1.2)kg/m2,細胞實際回輸與標(biāo)準(zhǔn)劑量百分比為(99.4±17.4)%。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)性別不限，年齡18～75歲；(2)臨床診斷為COPD[12],且具有明確的支氣管擴張病史；(3)病情穩(wěn)定2周以上，即咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩(wěn)定或幾乎消失，無咯血及痰中帶血，且血常規(guī)中白細胞及中性粒細胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原均在2周以上表現(xiàn)正常；(4)支氣管擴張范圍分布在6個肺段及以上，且能耐受纖維支氣管鏡檢查；(5)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)懷孕、哺乳或未采取有效避孕措施的育齡婦女;(2)梅毒、HIV抗體陽性;(3)患有各種惡性腫瘤;(4)患有以下任何一種肺部疾病：活動性肺結(jié)核、肺栓塞、氣胸、多發(fā)巨大肺大皰、哮喘未控制、慢性支氣管炎急性發(fā)作、極重度COPD等;(5)患有嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病，如糖尿病(血糖控制不佳)、心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、肝硬化、急性腎小球腎炎等;(6)任何原因造成的白細胞減少癥或粒細胞缺乏癥;(7)患有嚴(yán)重的肝臟疾病或肝腎功能損害；(8)有精神病史或自殺危險，有癲癇病或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史；(9)12- 導(dǎo)聯(lián)心電圖顯示具有嚴(yán)重的心律失常(如室性心動過速、頻發(fā)室上性心動過速、房顫、心房撲動等)或心臟Ⅱ度及以上傳導(dǎo)異常；(10)有酒精或違禁藥物濫用史；(11)入選前3個月內(nèi)已經(jīng)接受任何其他臨床試驗；(12)依從性差，難以完成研究；(13)研究者認(rèn)為可能存在增加受試者危險性或干擾臨床試驗的任何情況。本研究經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號NCT02722642)。

1.2方法

1.2.1支氣管基底層細胞治療前的采集、分離和培養(yǎng) 通過支氣管鏡刷檢的方法，從患者的3～5級支氣管中獲取微量組織分離提取支氣管基底層細胞。將獲得的組織沖洗下來，酶解消化成單細胞懸液后進行細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)系統(tǒng)為蘇州吉美瑞生醫(yī)學(xué)科技有限公司的專利技術(shù)，能夠選擇性地擴增支氣管基底層細胞，而其他類型的成熟上皮細胞和成纖維細胞等則無法生長而自然凋亡。支氣管基底層細胞在經(jīng)過一段時間擴增之后，保存在液氮細胞庫內(nèi)。在用于患者之前，進行微生物污染、細胞形態(tài)、細胞存活力、遺傳特性、Krt5標(biāo)記基因等檢測。

1.2.2支氣管基底層細胞治療的具體措施 胸部CT定位后，患者平臥位，在局部麻醉下經(jīng)鼻纖維支氣管鏡生理鹽水局部緩慢灌洗病灶部位的葉或段支氣管，每次50 mL，根據(jù)病灶范圍決定灌洗總量，病灶累及5個肺段及以下，每肺段灌洗150～200 mL；若病灶累及6個肺段及以上，每個肺段灌洗不超過150 mL(根據(jù)前期放射性肺纖維化局部灌洗經(jīng)驗，患者局部麻醉吸氧狀態(tài)下局部葉或段的肺灌洗耐受量在600 mL為宜)。在灌洗結(jié)束后，盡量吸盡病灶肺葉或肺段支氣管內(nèi)的液體，期間可間斷使用全身激素、支氣管擴張劑。待患者經(jīng)皮血氧飽和度為92%以上且生命體征平穩(wěn)后，再次經(jīng)纖維支氣管鏡將支氣管基底層細胞懸液注入病灶部位的葉或段支氣管。病灶在肺下野的各段支氣管，一次性注入各段支氣管5 mL自體支氣管基底層細胞懸液；病灶在肺上、中野的各段支氣管，一次性注入各段支氣管7 mL自體支氣管基底層細胞懸液，在完成移植后要求患者保持平臥狀態(tài)2 h左右。自體支氣管基底層細胞的細胞量為每人1×106個/kg。同時，在注入自體支氣管基底層細胞后，通過球囊置放以保證自體支氣管基底層細胞準(zhǔn)確而有效的定位及植入量，從而提高局部的移植率。治療后禁止使用的藥物：(1)全身用免疫抑制劑，包括吸入性激素(手術(shù)當(dāng)天允許使用)。(2)N- 乙酞半胱氨酸、秋水仙堿、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物、干擾素、抗細胞因子如腫瘤壞死因子- α(TNF- α)抑制劑。(3)吡非尼酮、轉(zhuǎn)化生長因子- β(TGF- β)抑制劑等經(jīng)動物試驗證明對于基底層細胞移植有促進作用的藥物。

1.2.3自體支氣管基底層細胞移植成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 在注入各段自體支氣管基底層細胞懸液并球囊置放2～3 min后，觀察相應(yīng)各段支氣管開口處是否有液體溢出，如果無明顯液體溢出，則判定為成功；如果有明顯液體溢出，則判定為失敗，需采取再次注入自體支氣管基層細胞的相應(yīng)措施。自體支氣管基底層細胞移植成功后，先拔出給藥管，后拔出纖維支氣管鏡。必要時可加用無創(chuàng)呼吸機雙側(cè)肺純氧通氣，以便自體支氣管基底層細胞和肺組織充分結(jié)合。術(shù)后禁食禁飲2 h，囑患者盡量減少咳嗽，必要時可給予可待因口服。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1肺功能指標(biāo) 于自體支氣管基底層細胞移植前和移植后4、12、24和48周，評估患者的肺功能相關(guān)指標(biāo)，包括第1秒用力呼氣容積(FEV1%)占預(yù)計值的百分比、用力肺活量(FVC)占預(yù)計值的百分比、FEV1/FVC、肺總量(TLC)占預(yù)計值的百分比、殘氣量(RV)占預(yù)計值的百分比、RV/TLC、一氧化碳彌散量(DLCO)占預(yù)計值百分比及DLCO與肺泡通氣量(VA)比值(DLCO/VA)，6 min步行距離及圣喬治呼吸問卷(SGRQ)評分。

1.3.2血常規(guī) 于自體支氣管基底層細胞移植前和移植后1、3、6個月，監(jiān)測患者的血常規(guī)相關(guān)指標(biāo)，包括白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白、血小板(PLT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)。

1.3.3肝腎功能指標(biāo) 于自體支氣管基底層細胞移植前和移植后1、3、6個月，監(jiān)測患者的肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和腎功能指標(biāo)尿素氮、肌酐。

1.3.4心肌酶譜指標(biāo) 于自體支氣管基底層細胞移植前和移植后1、3、6個月，監(jiān)測患者的心肌酶譜指標(biāo)肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)。

2 結(jié) 果

2.1肺功能指標(biāo) 基底層細胞移植后12、24、48周，患者6 min步行距離均較移植前有所增加，SGRQ評分較移植前有所降低(P<0.05)。FEV1占預(yù)計值的百分比、TLC占預(yù)計值的百分比、RV占預(yù)計值的百分比、RV/TLC有所增高，F(xiàn)VC占預(yù)計值的百分比、FEV1/FVC、DLCO占預(yù)計值百分比及DLCO/VA有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2血常規(guī) 基底層細胞移植前和移植后1、3、6個月，患者血常規(guī)指標(biāo)WBC、RBC、血紅蛋白、PLT和CRP均在正常值范圍內(nèi)，見表2。

2.3肝腎功能指標(biāo) 基底層細胞移植前和移植后1、3、6個月，患者肝功能指標(biāo)ALT、AST和腎功能指標(biāo)尿素氮、肌酐均在正常值范圍內(nèi)，見表3。

表1 COPD患者細胞移植前、后肺功能相關(guān)性指標(biāo)

-：該項缺失

表2 COPD患者細胞移植前、后血常規(guī)指標(biāo)

表3 COPD患者細胞移植前、后肝腎功能指標(biāo)

2.4心肌酶譜指標(biāo) 基底層細胞移植前和移植后1、3、6個月，患者心肌酶譜指標(biāo)CK和LDH均在正常值范圍內(nèi),見表4。

表4 COPD患者細胞移植前、后心肌酶譜 指標(biāo)

3 討 論

COPD的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，可能的原因為氧化- 抗氧化失衡導(dǎo)致氣道上皮細胞受損、蛋白酶- 抗蛋白酶失衡、炎性細胞增多、感染、肺內(nèi)細胞凋亡等。有研究顯示，COPD患者肺組織內(nèi)肺泡上皮細胞、結(jié)構(gòu)細胞和內(nèi)皮細胞等發(fā)生凋亡，細胞再生及繁殖能力相對不足，維持肺正常結(jié)構(gòu)及功能的能力下降，導(dǎo)致肺氣腫形成[13]，且在COPD患者早期，患者存在肺內(nèi)上皮祖細胞的衰竭[14]。而支氣管基底層細胞能夠不斷分化為各種類型的細胞，從而取代凋亡的細胞，維持肺的正常結(jié)構(gòu)和功能。在動物模型中，SOX9+支氣管基底層細胞、p63+Krt5+支氣管基底層細胞、成熟的氣管支氣管組織干細胞/祖細胞等被證實具有修復(fù)支氣管氣道的功能[7,15- 17]。

細胞治療早在20世紀(jì)70年代就開始在血液相關(guān)疾病治療中被廣泛應(yīng)用(輸血和骨髓移植)。但是近年來逐漸興起，運用到其他組織器官疾病的治療中，如皮膚細胞移植治療燒傷、肝實質(zhì)細胞移植治療肝衰竭和其他肝代謝類疾病、角膜緣細胞移植治療角膜損傷等。自體細胞治療存在以下優(yōu)點：(1)細胞來源于自身，不存在免疫排斥問題。(2)細胞來源于成體組織器官，本身即是身體的一部分，故不存在成瘤的風(fēng)險。(3)細胞具有可塑性，其分裂和遷移能力活躍，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中可以補充凋亡或壞死的同組織或同類型細胞。(4)操作簡單，移植是通過各種輸注途徑來實現(xiàn)的。(5)多種治療機制，包括通過遷移到組織受損部位并分化為正常組織細胞發(fā)揮修復(fù)作用，或者通過旁分泌機制，分泌各種抗炎因子，抑制促炎因子分泌發(fā)揮作用。

關(guān)于支氣管擴張的細胞治療在ClinicalTrial.gov注冊的僅有1項，是美國2015年12月4日注冊的NCT02625246觀察骨髓來源細胞對非囊性纖維化支氣管擴張的安全性、耐受性和潛在有效性研究。應(yīng)用自體支氣管基底層細胞移植治療COPD在國內(nèi)外尚鮮見報道。

根據(jù)COPD診治指南，COPD的管理目標(biāo)為減輕當(dāng)前癥狀，包括緩解癥狀、改善運動耐量和改善健康狀況；降低未來風(fēng)險，包括防止疾病進展、防止和治療急性加重和降低病死率[18]。本研究中，患者移植自體基底層細胞12、24、48周后，6 min步行距離均較移植前有所增加，SGRQ評分較移植前有所降低，說明患者的肺功能有所好轉(zhuǎn)，生活質(zhì)量有所提高。雖然患者的FEV1占預(yù)計值百分比、TLC占預(yù)計值百分比、RV占預(yù)計值百分比、RV/TLC有所增高，F(xiàn)VC占預(yù)計值百分比、FEV1/FVC、DLCO占預(yù)計值百分比及DLCO/VA有所降低，但變化都不明顯，提示自體基底層細胞移植防止了COPD的進一步加重。另外，移植自體基底層細胞后1、3、6個月，患者的血常規(guī)指標(biāo)、肝腎功能指標(biāo)、心肌酶譜指標(biāo)都在正常范圍內(nèi)，說明該細胞移植方法安全。

綜上所述，自體SOX9+支氣管基底層細胞移植治療COPD患者是有效和安全的，但本研究屬于探索性研究，樣本量較小，具體該細胞移植的有效性和安全性尚需進一步多中心、大樣本的隨機臨床對照研究進行驗證。