吳仕輝,黃芙蓉,雷 劍

(1.廣州市華萊科檢測技術(shù)有限公司//農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 511400;2、清遠(yuǎn)海貝生物技術(shù)有限公司,廣東 清遠(yuǎn) 511500)

近年來,由于玉米、豆粕等飼料原料價(jià)格上漲,飼料資源短缺的問題日益嚴(yán)重,同時(shí)隨著禁抗令全面實(shí)施,飼料行業(yè)面臨新的挑戰(zhàn)。在這種背景下,發(fā)酵飼料由于其不僅可提升部分營養(yǎng)成分含量,還具有促生長、改善適口性、調(diào)節(jié)腸道pH值、提高動物對飼料的消化率、降低抗?fàn)I養(yǎng)因子等作用[1-4],在飼料行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。目前評估發(fā)酵飼料產(chǎn)品品質(zhì)的指標(biāo)主要包括益生菌及其代謝產(chǎn)物、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白、總酸和有機(jī)酸等[5]。其中乳酸又稱2-羥基丙酸、α-羥基丙酸,是一種非常重要的有機(jī)酸,是評價(jià)發(fā)酵類產(chǎn)品發(fā)酵程度的重要指標(biāo)之一。因此,準(zhǔn)確測定發(fā)酵飼料中乳酸的含量具有十分重要的意義。目前,乳酸的檢測方法主要有滴定法和高效液相色譜法[6],由于滴定法測定的是總酸的含量,而不是乳酸的含量,同時(shí),滴定的終點(diǎn)以顏色來判斷,誤差較大[7]。有關(guān)液相色譜法檢測乳酸的報(bào)道主要集中在食品和釀酒行業(yè)[8]。在飼料行業(yè),GB/T 23877—2009《飼料酸化劑中檸檬酸、富馬酸和乳酸的測定 高效液相色譜法》僅適用于酸化劑類飼料添加劑產(chǎn)品中乳酸含量的檢測[9]。郭子好等[10-11]在GB/T 23877—2009的基礎(chǔ)上,對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,方法僅適用于發(fā)酵豆粕,具有一定的局限性。發(fā)酵類飼料產(chǎn)品由于在發(fā)酵過程中產(chǎn)生較多的小分子物質(zhì),基質(zhì)較為復(fù)雜,對乳酸的檢測干擾嚴(yán)重,目前適用于不同類型發(fā)酵飼料樣品檢測的通用型方法鮮有報(bào)道。本研究旨在建立一種準(zhǔn)確測定發(fā)酵飼料中乳酸含量的通用型檢測方法,為發(fā)酵飼料類產(chǎn)品的質(zhì)量評估提供檢測技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇,色譜純,德國默克公司;無水乙醇和甲醇,分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;磷酸,色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乳酸標(biāo)準(zhǔn)品,純度≥99%,北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;強(qiáng)陰離子固相萃取柱(SAX),1 000 mg,6 mL,日照科譜諾新材料有限公司;樣品1～6號分別是購買自市面上不同供應(yīng)商和不同地區(qū)的發(fā)酵豆粕、發(fā)酵豬飼料、發(fā)酵畜禽飼料、玉米漿液、玉米漿粉、發(fā)酵蟲沙等產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀,具紫外檢測器,美國沃特世公司;電子分析天平,常州;超純水機(jī),德國默克密理博實(shí)驗(yàn)室純水公司;玻璃纖維濾紙,北京中檢維康生物技術(shù)有限公司;超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;渦旋混勻儀,杭州佑寧儀器有限公司;50 mL具塞離心管,無錫耐思生命科技股份有限公司;臺式離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;微量移液器,德國艾本德股份公司;2 mL無菌注射器,江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司;0.45 μm水系濾膜,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

Ultimate R OAA有機(jī)酸專用色譜柱(5 μm,4.6 mm×300 mm),流動相:100% 0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH=2.5),流速:1 mL/min,柱溫:32℃,檢測器波長:210 nm,進(jìn)樣量:10 μL。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取30.0 mg乳酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,用0.1%磷酸溶液溶解并定容至刻度,混勻,該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濃度為3 mg/mL,有效期為3個(gè)月。準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用0.1%磷酸溶液稀釋配制乳酸濃度分別為:1、6、30、150、300 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。臨用前現(xiàn)配。

1.3.3發(fā)酵飼料樣品中乳酸的提取

準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL純水,渦旋震蕩5 min,在4 000 r/min下離心3 min后,將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,向殘?jiān)屑尤?0 mL純水重復(fù)提取1次,合并提取液于同一容量瓶中,用無水乙醇定容,混勻。

取適量樣液過玻璃纖維濾紙,準(zhǔn)確移取10.0 mL濾液于100 mL雞心瓶中,向雞心瓶中加入10 mL無水乙醇,在80℃±2℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干,再加入5 mL無水乙醇繼續(xù)濃縮至干,在雞心瓶中加入純水多次溶解殘?jiān)?根據(jù)樣品含量的不同,參照表1將樣液轉(zhuǎn)移至5～100 mL容量瓶中進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尣⒍ㄈ?。?.5 mL稀釋后的樣液過經(jīng)活化(使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化)的SAX固相萃取柱,再用5 mL純水淋洗凈化柱,最后用5 mL 2%磷酸甲醇溶液洗脫,收集洗脫液于50 mL雞心瓶中,洗脫液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后,用5 mL 0.1%磷酸溶液振蕩溶解并過0.45 μm水系濾膜后,注入高效液相色譜儀分析。

表1 不同乳酸含量的樣品對應(yīng)不同稱樣量的建議

1.3.4發(fā)酵飼料中乳酸的檢測

分別吸取10 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液,注入液相色譜儀檢測,以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo),以對應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行回歸計(jì)算得到乳酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù),檢測樣品中乳酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

比較了3種色譜柱對樣品分離效果的影響,分別為Agilent C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)、資生堂C18色譜柱(3 μm,4.6 mm×150 mm)、Ultimate R OAA有機(jī)酸專用色譜柱(5 μm,4.6 mm×300 mm)。發(fā)酵飼料樣品經(jīng)純水直接提取后(參見2.2.1),采用0.1%磷酸溶液∶甲醇=97.5∶2.5為流動相,分別選擇上述3種色譜柱進(jìn)行分析。圖譜分別如圖1、圖2、圖3所示。可以看出圖3(有機(jī)酸專用柱)目標(biāo)峰受雜質(zhì)干擾程度最小,分離效果最好。因此最終選擇有機(jī)酸專用柱進(jìn)行樣品分析。

圖1 Agilent C18柱測定樣品中乳酸含量的液相色譜圖

圖2 資生堂C18色譜柱測定樣品中乳酸含量的液相色譜圖

圖3 有機(jī)酸專用柱測定樣品中乳酸含量的液相色譜圖

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取方法的選擇

采用直接提取法:稱取2.00 g發(fā)酵飼料置于100 mL容量瓶中,加60 mL水,60℃超聲提取30 min,冷卻至室溫,用水定容至刻度搖勻,過玻璃纖維濾紙至澄清,取適量濾液過0.45 μm水系濾膜,注入高效液相色譜儀中,樣品的圖譜如圖3所示。

采用固相萃取法:樣品經(jīng)純水提取后,過SAX固相萃取柱小柱凈化(參見1.3.3),取適量濾液過0.45 μm水系濾膜,注入高效液相色譜儀中,樣品的圖譜如圖4所示。

圖4 固相萃取法測定樣品中乳酸含量的液相色譜圖

由圖3和圖4可以看出,樣品經(jīng)固相萃取凈化后,分離效果有了明顯的提升,目標(biāo)峰分離度較好,峰型尖銳,且雜質(zhì)對目標(biāo)峰無干擾,能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行定量,所以本實(shí)驗(yàn)采用SAX固相萃取柱進(jìn)行凈化處理。

2.2.2稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響

由于發(fā)酵飼料樣品中乳酸含量較高且跨度范圍大,為防止乳酸含量過高導(dǎo)致的固相萃取小柱過載問題,我們進(jìn)一步驗(yàn)證了稀釋倍數(shù)對結(jié)果的影響。取發(fā)酵豆粕樣品,經(jīng)純水提取,無水乙醇定容至100 mL后,將樣液分別經(jīng)1.25、2.5、5、10倍稀釋后過活化的固相萃取柱,并分別收集經(jīng)固相萃取小柱后的樣液和淋洗液上機(jī)測試,并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較,如表2所示。

表2 同一樣品不同稀釋倍數(shù)的測定結(jié)果

由表2數(shù)據(jù)可以看出,收集的樣液和淋洗液中均檢測出不同含量的乳酸,且乳酸含量隨著樣品稀釋倍數(shù)的增大而減小,說明樣液中乳酸含量太高,導(dǎo)致過固相萃取柱時(shí)目標(biāo)物過載,目標(biāo)物不能全部保留在小柱上;當(dāng)樣品的稀釋倍數(shù)為10倍時(shí),在收集的樣液和淋洗液中均未檢測出乳酸,所以對于發(fā)酵豆粕樣品以及含量與之相當(dāng)?shù)钠渌N類的樣品,均要將樣品至少稀釋10倍以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因此對于不同乳酸含量的發(fā)酵飼料樣品,我們在實(shí)際操作過程中要根據(jù)樣品情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?具體參照表2。

2.3 流動相的優(yōu)化

分別采用0.1%磷酸溶液∶甲醇=97.5∶2.5和100% 0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(pH=2.5)作為流動相,分別對標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液進(jìn)行上機(jī)測試。對于標(biāo)準(zhǔn)溶液,兩種流動相都能獲得良好的分離度,其中用100% 0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(pH=2.5)作為流動相的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖5。

圖5 乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

但是對于樣品溶液,可以看出,用100% 0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(pH=2.5)作為流動相(見圖6),目標(biāo)物峰型尖銳,且不受雜質(zhì)干擾,明顯優(yōu)于0.1%磷酸溶液∶甲醇=97.5∶2.5流動相(見圖4);同時(shí),由于無有機(jī)溶液參與,檢測成本更低,更環(huán)保。

圖6 流動相優(yōu)化后測定樣品中乳酸含量的液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系與方法檢出限和定量限

精確配制1、6、30、150、300 mg/L 5個(gè)濃度梯度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)前面優(yōu)化好的液相方法進(jìn)行上機(jī)分析,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:Y=2.79e+002X+7.09e+001,相關(guān)系數(shù)R2=1.000 0,表明乳酸溶液在1～300 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法,依據(jù)色譜峰的信噪比S/N≥3為檢出限,S/N≥10為定量限,得到發(fā)酵飼料樣品中乳酸的檢出限為30 mg/kg,見圖7,定量限為50 mg/kg,見圖8。

圖7 方法檢出限的高效液相色譜圖

圖8 方法定量限的高效液相色譜圖

2.5 方法重復(fù)性與回收率

選取1個(gè)發(fā)酵豆粕樣品,分為6份,每份2.00 g,同時(shí)檢測乳酸的含量,結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,該方法對于檢測發(fā)酵豆粕中乳酸含量的結(jié)果重復(fù)性好,批間或批內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值符合一般檢測方法小于10%的要求。

表3 同一發(fā)酵豆粕6次的檢測數(shù)據(jù)

選取1個(gè)發(fā)酵飼料樣品,分別加入不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,算得的濃度減去未加標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品中乳酸的濃度計(jì)算方法的回收率,結(jié)果如表4所示。由表4可知,加標(biāo)量為456～2 299 mg/kg,回收率在86.6%～98.0%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法的回收率良好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表4 發(fā)酵飼料加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.6 方法適用性

將該方法應(yīng)用于飼料行業(yè)內(nèi)用量較大的產(chǎn)品如酒糟類、發(fā)酵棉粕、菜粕、豆粕、發(fā)酵畜禽飼料、發(fā)酵玉米、發(fā)酵玉米漿液等不同種類的12種發(fā)酵飼料中的乳酸含量測定,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,玉米漿粉的乳酸含量最高,高脂醬油糟的乳酸含量最低。本次檢測的發(fā)酵飼料樣品的乳酸含量范圍在0.1%～23.1%,說明由于發(fā)酵原料來源和發(fā)酵工藝的差異,不同發(fā)酵飼料產(chǎn)品的乳酸含量差距較大,乳酸作為發(fā)酵飼料成品的主要質(zhì)量指標(biāo)之一,該方法可以提供重要的乳酸檢測技術(shù)支撐。

表5 不同的發(fā)酵飼料產(chǎn)品的乳酸含量測定數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜和紫外檢測器,用外標(biāo)法定量計(jì)算,建立了發(fā)酵飼料中乳酸含量的測定方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法具有抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確的特點(diǎn),特別適合于發(fā)酵類飼料樣品中乳酸的測定。同時(shí)從不同的發(fā)酵飼料樣品的乳酸檢測結(jié)果來看,不同廠家的發(fā)酵工藝和程度不一樣,其中乳酸含量也存在較大差異,影響發(fā)酵工藝的參數(shù)有很多,此方法的建立對乳酸用發(fā)酵飼料的生產(chǎn)改進(jìn)和質(zhì)量提升具有積極的意義和較高的參考價(jià)值。