李 泰,朱英才,駱 璐,彭 強(qiáng),凌洪權(quán),廖星杰,王 欽,張承雙

(重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120)

標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1946-2010中給出了檢測(cè)飼料中牛羊源性成分的具體方法,但是在日常的檢測(cè)工作中,如果僅是按照標(biāo)準(zhǔn)提示,而沒(méi)有弄清實(shí)驗(yàn)中若干重要的節(jié)點(diǎn)部分,則會(huì)出現(xiàn)相同的檢測(cè)樣品,不同的結(jié)果。為了說(shuō)明這一問(wèn)題,本試驗(yàn)購(gòu)買(mǎi)了市面上提取核酸主要的幾類(lèi)試劑盒A、B、C和D,D為手提試劑盒,其余三個(gè)為機(jī)提試劑盒,通過(guò)實(shí)驗(yàn)比對(duì),發(fā)現(xiàn)機(jī)提試劑盒A和手提試劑盒D提取的DNA在后續(xù)的熒光PCR實(shí)驗(yàn)中有Ct值,其他兩個(gè)沒(méi)有,而有Ct值的,其結(jié)果也不能很好地相互印證,本研究通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)的比對(duì),發(fā)現(xiàn)核酸提取試劑盒是影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器

Bio-Rad CFX96TMReal-Time System C1000 TouchTMThermal Cycler(Bio-Rad, USA),全自動(dòng)核酸提取儀(S廠家),SmartSpecTMPlus Spectrophotometer(Bio-Rad, USA) 。

1.1.2主要試劑

核酸機(jī)提試劑盒A;核酸手提試劑盒D;羊源性成分(Ovine)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法),批號(hào):OVIN22072901,生產(chǎn)日期:2022-07-29,有效期至2023-07-28,廣州維伯鑫生物科技股份有限公司;牛源性成分(Bovine)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法),批號(hào):BOVI230113011,生產(chǎn)日期:2023-01-13,有效期至2024-01-12,廣州維伯鑫生物科技股份有限公司。

1.1.3主要材料

Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip, white, Catalog# TLS0851,BIO-RAD; Optical Flat 8-cap strips for 0.2 ml tube strips/plates, Catalog# TCS0803,BIO-RAD;Sharpie marker, USA.

1.2 方法

首先通過(guò)預(yù)試驗(yàn),對(duì)4個(gè)核酸提取試劑盒進(jìn)行篩選。再稱(chēng)取魚(yú)粉、陰性對(duì)照(該陰性對(duì)照是以前用普通PCR檢測(cè)定性的被檢樣品)、0.1%陽(yáng)性對(duì)照和0.25%陽(yáng)性對(duì)照各兩份,每份50 mg,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(水),隨機(jī)分成兩組,按照NY/T 1946-2010和核酸提取試劑盒的操作要求,用優(yōu)選的機(jī)提試劑盒A和手提試劑盒D分別進(jìn)行獨(dú)立的核酸提取。提取的核酸再分別進(jìn)行牛源性成分和羊源性成分熒光PCR法核酸檢測(cè),操作步驟和上機(jī)檢測(cè)程序按照核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。通過(guò)對(duì)檢測(cè)的Ct值進(jìn)行比對(duì),了解核酸提取試劑盒的選擇在檢測(cè)飼料中牛羊源性成分中的重要性。

2 結(jié)果

空白對(duì)照(水)、魚(yú)粉和陰性對(duì)照分別經(jīng)核酸機(jī)提試劑盒A處理,熒光PCR檢測(cè),其牛羊源性成分Ct值均為無(wú),0.1%陽(yáng)性對(duì)照的牛羊源性成分Ct值分別為30.38和28.38,0.25%陽(yáng)性對(duì)照的牛羊源性成分Ct值分別為28.03和27.04。經(jīng)核酸手提試劑盒D處理的空白對(duì)照(水),其核酸經(jīng)熒光PCR檢測(cè)牛羊源性成分Ct值均為無(wú),魚(yú)粉的牛羊源性成分Ct值分別為37.00和39.67,陰性對(duì)照的牛羊源性成分Ct值分別為39.33和37.21,0.1%陽(yáng)性對(duì)照的牛羊源性成分Ct值分別為22.97和21.79,0.25%陽(yáng)性對(duì)照的牛羊源性成分Ct值分別為21.87和21.04,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩種核酸提取試劑盒的檢測(cè)情況

3 討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,0.25%陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)核酸手提試劑盒D處理與經(jīng)核酸機(jī)提試劑盒A處理,其牛羊源性成分Ct值兩者平均值相差為6;同樣,0.1%陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)兩種提取試劑盒處理,其Ct值平均相差為7。經(jīng)核酸手提試劑盒D處理的陰性對(duì)照,其牛羊源性成分Ct值的平均值為38.27,那么核酸機(jī)提試劑盒A處理的陰性對(duì)照,其牛羊源性成分Ct值的平均值就約為44.77;同樣,經(jīng)核酸手提試劑盒D處理的魚(yú)粉,其牛羊源性成分Ct值的平均值為38.335,那么核酸機(jī)提試劑盒A處理的魚(yú)粉其牛羊源性成分Ct值的平均值就約為44.835,但事實(shí)上,核酸機(jī)提試劑盒A處理的陰性對(duì)照和魚(yú)粉,其牛羊源性成分Ct值均為無(wú),其實(shí)這是因?yàn)镃t值44.77和44.835已經(jīng)超出了試劑盒的檢測(cè)范圍,而進(jìn)一步溯源則是因?yàn)楹怂崽崛≡噭┖胁煌?經(jīng)核酸手提試劑盒D處理得到的核酸,其濃度和A260/A280值均高于核酸機(jī)提試劑盒A所提取核酸的指標(biāo)(數(shù)據(jù)未展示)。

含牛羊源性成分的動(dòng)物源性飼料的使用[1],被認(rèn)為是瘋牛病傳播的主要途徑,禁止疫區(qū)含牛羊源性成分的動(dòng)物源性飼料的生產(chǎn)、流通和使用,是預(yù)防瘋牛病感染、流行的主要手段之一[2-4]。同時(shí)隨著飼料工業(yè)的精細(xì)化發(fā)展,特別是部分部門(mén)和人群(如進(jìn)出口貿(mào)易和兒童)對(duì)肉品質(zhì)量的更高要求,就亟需嚴(yán)把飼料檢測(cè)環(huán)節(jié)。為切實(shí)強(qiáng)化飼料質(zhì)量安全監(jiān)管,提高畜產(chǎn)品質(zhì)量安全水平,促進(jìn)畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展[5],在運(yùn)用熒光PCR法檢測(cè)飼料中牛羊源性成分時(shí)[6-7],更應(yīng)注意核酸提取試劑盒的選擇。