国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx

胃癌中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

2024-02-27 11:50:10費哲為
醫(yī)學(xué)研究雜志 2024年1期
關(guān)鍵詞:結(jié)果表明細(xì)胞系引物

吳 航 費哲為

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,世界范圍內(nèi)其發(fā)生率和病死率分別居于所有惡性腫瘤的第5位和第4位[1]。目前胃癌在我國仍是發(fā)生率居于首位的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅我國國民健康[2]。盡管近年來胃癌的診療取得了很大的進(jìn)步,以手術(shù)治療、化療、放療和免疫治療為主的綜合治療顯著改善了胃癌患者的生活質(zhì)量和生存期限[3]。但由于胃癌早期往往沒有典型癥狀,導(dǎo)致部分患者被診斷時已喪失手術(shù)機會,晚期胃癌患者的生活質(zhì)量和預(yù)后仍不能令人滿意[4]。因此,迫切需要探究胃癌發(fā)生和發(fā)展的詳細(xì)分子機制,以獲得更有效的治療策略。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子,其中一些lncRNA具有編碼功能性微肽的能力[5]。越來越多的研究表明,lncRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中起到重要作用。近年來,多種與胃癌相關(guān)的lncRNA分子被發(fā)現(xiàn),例如H19、MALAT1、HOTAIR等可通過調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力繼而影響胃癌的惡性生物學(xué)行為[6~8]。lncRNA HOXA-AS2是位于HOXA3基因和HOXA4基因之間的長度為1048個堿基的RNA分子,多項研究表明lncRNA HOXA-AS2在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種癌癥中異常表達(dá)且發(fā)揮癌基因的功能[9~11]。然而,關(guān)于lncRNA HOXA-AS2在胃癌中所發(fā)揮的作用仍不清楚,因此本研究的主要目的是探究lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達(dá)情況及其對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)的影響。

資料與方法

1.臨床樣本和資料:回顧性分析2020年2~12月筆者醫(yī)院收治的45例胃癌患者的臨床及病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者在手術(shù)前未接受過放療及化療;②術(shù)后病理明確診斷為胃癌;③患者未合并其他原發(fā)惡性腫瘤。術(shù)中取胃癌組織及距離胃癌5cm以上的癌旁組織迅速放入液氮快速冷凍,后期統(tǒng)一于-80℃冰箱保存。所有入組胃癌患者均簽署書面知情同意書,本研究通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號:CMEC-2021-KT-02)。

2.細(xì)胞系和主要試劑:人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES和人胃癌細(xì)胞系BGC-823、HGC-27、SGC-7901、MGC803及MKN-45購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海);DMEM、RMPI-1640培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清購自美國Gibco公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑購自上海碧云天生物技術(shù)公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)科技公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司;Transwell小室購自美國Corning公司;lncRNA HOXA-AS2、GAPDH引物使用primer5軟件設(shè)計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,lncRNA HOXA-AS2 siRNA由上海吉滿生物科技公司設(shè)計合成。

3.lncRNA HOXA-AS2相對表達(dá)水平的檢測:使用Trizol提取組織和細(xì)胞中的總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應(yīng)。lncRNA HOXA-AS2引物序列為:上游引物:5′-CACGCTTTTCCCGTAGGAAG-3′,下游引物:5′-CTGCTCCAAAACTCTTCGCC-3′;內(nèi)參GAPDH引物序列為:上游引物:5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3′,下游引物:5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′。按照制造商的說明進(jìn)行熒光定量PCR的實驗,所有實驗重復(fù)3次,用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達(dá)水平。

4.生物信息分析:利用生物信息分析在線網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter分析lncRNA HOXA-AS2對胃癌患者預(yù)后的影響。

5.細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染:人胃癌細(xì)胞系HGC-27和MKN-45在補充有10%胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時將其接種在6孔板中并分為對照(NC)組,Si1組和Si2組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。所有操作嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行,轉(zhuǎn)染24h后,提取細(xì)胞總RNA,按照諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng),以2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)水平,驗證siRNA的敲減效果。

6.細(xì)胞增殖能力檢測:采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的SiNC、Si1和Si2 3組細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液,在96孔板中分別接種轉(zhuǎn)染后的HGC-27和MKN-45細(xì)胞,每孔3000個細(xì)胞,每組設(shè)置6個復(fù)孔,分別在培養(yǎng)后0、24、48和72h 4個時間點避光加入含10μl CCK-8的培養(yǎng)基(100μl)檢測HGC-27和MKN-45細(xì)胞的增殖情況,并在37℃下避光孵育2h,然后使用酶標(biāo)儀記錄每個孔在450nm處的吸光度(A)值。

7.克隆形成實驗:將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔500個細(xì)胞的密度接種至6孔板中,每3天換液1次,連續(xù)培養(yǎng)2周。在預(yù)定的時間點加入4%多聚甲醛固定15min。并在常溫下加入濃度為0.5%的結(jié)晶紫溶液染色15min,洗凈培養(yǎng)板,進(jìn)行拍照和統(tǒng)計分析。

8.劃痕實驗:將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到6孔板中,每孔約5×105個細(xì)胞,確保過夜后細(xì)胞長滿,第2天利用槍頭進(jìn)行劃痕,每孔等間隔劃4條直線,加入PBS洗去未貼壁細(xì)胞,加入不含血清的培養(yǎng)基,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,使用倒置相差顯微鏡進(jìn)行拍照并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

9.Transwell侵襲實驗:取處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,使用0.25%的胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液,接種到含Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室的上室(100μl),下室添加600μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后,使用4%多聚甲醛固定10min后使用0.5%的結(jié)晶紫染色10min。顯微鏡下拍照并統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù)量。

結(jié) 果

1.lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá):熒光定量PCR結(jié)果表明,與癌旁組織比較,lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1A);lncRNA HOXA-AS2 在所有檢測胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平均高于人正常胃黏膜細(xì)胞系GES,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1B),其中以HGC-27和MKN-45細(xì)胞的表達(dá)水平最高(P<0.001,圖1B),因此選取這兩株細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能實驗。

圖1 lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)與生存分析

2.lncRNA HOXA-AS2與胃癌患者生存分析:通過生物信息分析在線網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter分析lncRNA HOXA-AS2對胃癌患者預(yù)后的影響,公共數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明,lncRNA HOXA-AS2高表達(dá)組的總生存期為30.2個月低于lncRNA HOXA-AS2低表達(dá)組的123.8個月,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1C)。

3.lncRNA HOXA-AS2 與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系:為探討胃癌組織中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2表達(dá)水平的臨床意義,根據(jù)胃癌組織中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)情況,將患者分為高表達(dá)組(n=25)和低表達(dá)組(n=20)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明,lncRNA HOXA-AS2的高表達(dá)水平與與胃癌分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)(P<0.05),但lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05,表1)。

表1 45例胃癌組織中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(n)

4.siRNA轉(zhuǎn)染效果:細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后,通過熒光定量PCR檢測lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平探究siRNA的轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果表明,Si1和Si2均能成功干擾HGC-27和MKN-45細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平(P<0.05,圖2)。

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染后HGC-27和MKN-45細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)

5.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞增殖能力的影響:敲低lncRNA HOXA-AS2后利用CCK-8法檢測HGC-27和MKN-45細(xì)胞的增殖能力,與SiNC組比較,Si1組和Si2組HGC-27、MKN-45的細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05,圖3)。

圖3 敲減lncRNA HOXA-AS2后對HGC-27(A)和MKN-45(B)細(xì)胞增殖能力的影響

6.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞克隆形成能力的影響:NC組、Si1組和Si2組HGC-27細(xì)胞的克隆數(shù)目分別為321.00±32.15、70.00±3.30、135.00±9.26;NC組、Si1組和Si2組MKN-45細(xì)胞的克隆數(shù)目分別為395.00±23.90、106.50±11.52、190.00±18.38。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著減少HGC-27和MKN-45細(xì)胞的克隆集落數(shù)目(P<0.05,圖4)。

圖4 沉默lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞克隆能力的影響

7.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞遷移能力的影響:如劃痕實驗結(jié)果所示(圖5),NC組HGC-27和MKN-45細(xì)胞的遷移愈合率分別為69.12%±6.23%和57.38%±4.34%;HGC-27細(xì)胞Si1組和Si2組的細(xì)胞遷移愈合率分別為17.37%±2.18%和29.72%±3.36%;MKN-45細(xì)胞Si 1組和Si 2組的細(xì)胞遷移愈合率分別為13.55%±1.20%和24.89%±2.06%。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著降低HGC-27和MKN-45細(xì)胞的遷移(P<0.05)。

圖5 沉默 lncRNA HOXA-AS2后對HGC-27和MKN-45細(xì)胞遷移能力的影響

8.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲能力的影響:NC組HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲數(shù)分別為424.00±32.89和381.00±35.03;Si1組HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲數(shù)分別為68.00±5.70和97.00±8.58;Si2組HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲數(shù)分別為122.00±7.82和198.00±10.70。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著降低HGC-27和MKN-45細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05,圖6)。

圖6 沉默lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲能力的影響

討 論

近年來,胃癌的診療取得了很大的進(jìn)步,特別是以手術(shù)治療、化療、放療和新輔助化療為主的綜合治療的實施,早期胃癌患者的5年生存率已達(dá)到95%[12]。但由于胃癌早期缺乏典型的癥狀,大部分患者被診斷時已錯過手術(shù)治療的最佳時期,伴有局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者的5年生存率還不足20%[13]。當(dāng)前,針對晚期胃癌患者的治療主要以化療和靶向療法為主,然而藥物的毒性不良反應(yīng)以及耐藥性的產(chǎn)生往往導(dǎo)致晚期胃癌患者較差的預(yù)后和生活質(zhì)量的降低[14]。因此,闡明胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制,為胃癌患者尋求新的治療策略是極其必要的。

測序技術(shù)的進(jìn)步使得人們能夠更深入的進(jìn)行基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn),人類基因組只有不到2%的轉(zhuǎn)錄本可以翻譯成蛋白質(zhì),其余98%的轉(zhuǎn)錄本被稱為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)[15]。ncRNA雖然不編碼蛋白質(zhì),但其在細(xì)胞生物學(xué)活動中發(fā)揮著重要作用,長度超過200個核苷酸的ncRNA被稱為lncRNA[16]。越來越多的研究表明,lncRNA直接或者間接參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的分子機制,調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞信號通路,并表現(xiàn)出致癌或抑癌作用[15]。Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌中l(wèi)ncRNA HGBC的表達(dá)水平顯著上調(diào),高表達(dá)的lncRNA HGBC與患者的不良預(yù)后相關(guān),進(jìn)一步探究相關(guān)機制發(fā)現(xiàn),lncRNA HGBC可通過海綿化miR-502-3p繼而激活A(yù)kt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)膽囊癌的進(jìn)展。Dong等[18]利用微陣列對曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞及親代細(xì)胞進(jìn)行測序分析,結(jié)果表明lncRNA TINCR的表達(dá)水平在曲妥珠耐藥細(xì)胞系中顯著上調(diào),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TINCR不僅可以通過上調(diào)HER-2的表達(dá)來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥性的產(chǎn)生,其還可以靶向Snail-1誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)一步加強乳腺癌細(xì)胞對曲妥珠單抗的耐藥性。諸多報道證實,lncRNA HOXA-AS2在多種癌癥中失調(diào),其失調(diào)可促進(jìn)多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展,但lncRNA HOXA-AS2在胃癌中的表達(dá)水平及所發(fā)揮的作用目前仍不清楚。

本研究表明,與癌旁組織比較, lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著升高,提示其在胃癌中可能發(fā)揮致癌基因的作用,進(jìn)一步驗證lncRNA HOXA-AS2在人正常胃黏膜細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),lncRNA HOXA-AS2在人胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。通過在線生信網(wǎng)站分析了lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系,結(jié)果表明lncRNA HOXA-AS2低表達(dá)組的胃癌患者的總生存期要遠(yuǎn)長于lncRNA HOXA-AS2高表達(dá)組胃癌患者的生存期,提示lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平還與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。接下來分析了lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系,統(tǒng)計分析結(jié)果表明,lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與與腫瘤分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān),而與患者的年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。進(jìn)一步探究了lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)的影響,并成功利用siRNA下調(diào)了胃癌細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)。體外實驗結(jié)果表明,敲減lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平后,胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均被抑制,表明lncRNA HOXA-AS2在胃癌細(xì)胞中充當(dāng)促癌基因。

綜上所述,本研究初步證實lncRNA HOXA-AS2在胃癌中發(fā)揮促癌分子作用。lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)。lncRNA HOXA-AS2的高表達(dá)與胃癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、預(yù)后呈正相關(guān)。敲低lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)后顯著抑制了胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,結(jié)果提示 lncRNA HOXA-AS2可能在胃癌中發(fā)揮促癌基因的作用,但lncRNA HOXA2促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機制還需開展進(jìn)一步研究予以證實。

猜你喜歡
結(jié)果表明細(xì)胞系引物
DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響
抑制miR-31表達(dá)對胰腺癌Panc-1細(xì)胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
E3泛素連接酶對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
七葉皂苷鈉與化療藥聯(lián)合對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用
體育鍛煉也重要
闊世瑪與世瑪用于不同冬小麥品種的安全性試驗
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
怀仁县| 望谟县| 宁夏| 马公市| 怀仁县| 天门市| 垫江县| 维西| 濉溪县| 定南县| 庆城县| 庄河市| 云霄县| 许昌县| 枝江市| 大埔县| 晴隆县| 石泉县| 宜兰县| 永靖县| 旬邑县| 马尔康县| 什邡市| 桃源县| 威海市| 承德县| 沐川县| 铅山县| 股票| 蒙阴县| 镇巴县| 洮南市| 孟州市| 沾益县| 化德县| 湛江市| 临潭县| 新河县| 维西| 山阳县| 林芝县|