吳 航 費哲為
胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,世界范圍內(nèi)其發(fā)生率和病死率分別居于所有惡性腫瘤的第5位和第4位[1]。目前胃癌在我國仍是發(fā)生率居于首位的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅我國國民健康[2]。盡管近年來胃癌的診療取得了很大的進(jìn)步,以手術(shù)治療、化療、放療和免疫治療為主的綜合治療顯著改善了胃癌患者的生活質(zhì)量和生存期限[3]。但由于胃癌早期往往沒有典型癥狀,導(dǎo)致部分患者被診斷時已喪失手術(shù)機會,晚期胃癌患者的生活質(zhì)量和預(yù)后仍不能令人滿意[4]。因此,迫切需要探究胃癌發(fā)生和發(fā)展的詳細(xì)分子機制,以獲得更有效的治療策略。
長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子,其中一些lncRNA具有編碼功能性微肽的能力[5]。越來越多的研究表明,lncRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中起到重要作用。近年來,多種與胃癌相關(guān)的lncRNA分子被發(fā)現(xiàn),例如H19、MALAT1、HOTAIR等可通過調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力繼而影響胃癌的惡性生物學(xué)行為[6~8]。lncRNA HOXA-AS2是位于HOXA3基因和HOXA4基因之間的長度為1048個堿基的RNA分子,多項研究表明lncRNA HOXA-AS2在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種癌癥中異常表達(dá)且發(fā)揮癌基因的功能[9~11]。然而,關(guān)于lncRNA HOXA-AS2在胃癌中所發(fā)揮的作用仍不清楚,因此本研究的主要目的是探究lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達(dá)情況及其對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)的影響。
1.臨床樣本和資料:回顧性分析2020年2~12月筆者醫(yī)院收治的45例胃癌患者的臨床及病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者在手術(shù)前未接受過放療及化療;②術(shù)后病理明確診斷為胃癌;③患者未合并其他原發(fā)惡性腫瘤。術(shù)中取胃癌組織及距離胃癌5cm以上的癌旁組織迅速放入液氮快速冷凍,后期統(tǒng)一于-80℃冰箱保存。所有入組胃癌患者均簽署書面知情同意書,本研究通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號:CMEC-2021-KT-02)。
2.細(xì)胞系和主要試劑:人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES和人胃癌細(xì)胞系BGC-823、HGC-27、SGC-7901、MGC803及MKN-45購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海);DMEM、RMPI-1640培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清購自美國Gibco公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑購自上海碧云天生物技術(shù)公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)科技公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司;Transwell小室購自美國Corning公司;lncRNA HOXA-AS2、GAPDH引物使用primer5軟件設(shè)計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,lncRNA HOXA-AS2 siRNA由上海吉滿生物科技公司設(shè)計合成。
3.lncRNA HOXA-AS2相對表達(dá)水平的檢測:使用Trizol提取組織和細(xì)胞中的總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應(yīng)。lncRNA HOXA-AS2引物序列為:上游引物:5′-CACGCTTTTCCCGTAGGAAG-3′,下游引物:5′-CTGCTCCAAAACTCTTCGCC-3′;內(nèi)參GAPDH引物序列為:上游引物:5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3′,下游引物:5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′。按照制造商的說明進(jìn)行熒光定量PCR的實驗,所有實驗重復(fù)3次,用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達(dá)水平。
4.生物信息分析:利用生物信息分析在線網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter分析lncRNA HOXA-AS2對胃癌患者預(yù)后的影響。
5.細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染:人胃癌細(xì)胞系HGC-27和MKN-45在補充有10%胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時將其接種在6孔板中并分為對照(NC)組,Si1組和Si2組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。所有操作嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行,轉(zhuǎn)染24h后,提取細(xì)胞總RNA,按照諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng),以2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)水平,驗證siRNA的敲減效果。
6.細(xì)胞增殖能力檢測:采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的SiNC、Si1和Si2 3組細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液,在96孔板中分別接種轉(zhuǎn)染后的HGC-27和MKN-45細(xì)胞,每孔3000個細(xì)胞,每組設(shè)置6個復(fù)孔,分別在培養(yǎng)后0、24、48和72h 4個時間點避光加入含10μl CCK-8的培養(yǎng)基(100μl)檢測HGC-27和MKN-45細(xì)胞的增殖情況,并在37℃下避光孵育2h,然后使用酶標(biāo)儀記錄每個孔在450nm處的吸光度(A)值。
7.克隆形成實驗:將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔500個細(xì)胞的密度接種至6孔板中,每3天換液1次,連續(xù)培養(yǎng)2周。在預(yù)定的時間點加入4%多聚甲醛固定15min。并在常溫下加入濃度為0.5%的結(jié)晶紫溶液染色15min,洗凈培養(yǎng)板,進(jìn)行拍照和統(tǒng)計分析。
8.劃痕實驗:將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到6孔板中,每孔約5×105個細(xì)胞,確保過夜后細(xì)胞長滿,第2天利用槍頭進(jìn)行劃痕,每孔等間隔劃4條直線,加入PBS洗去未貼壁細(xì)胞,加入不含血清的培養(yǎng)基,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,使用倒置相差顯微鏡進(jìn)行拍照并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
9.Transwell侵襲實驗:取處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,使用0.25%的胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液,接種到含Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室的上室(100μl),下室添加600μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后,使用4%多聚甲醛固定10min后使用0.5%的結(jié)晶紫染色10min。顯微鏡下拍照并統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù)量。
1.lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá):熒光定量PCR結(jié)果表明,與癌旁組織比較,lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1A);lncRNA HOXA-AS2 在所有檢測胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平均高于人正常胃黏膜細(xì)胞系GES,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1B),其中以HGC-27和MKN-45細(xì)胞的表達(dá)水平最高(P<0.001,圖1B),因此選取這兩株細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能實驗。
圖1 lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)與生存分析
2.lncRNA HOXA-AS2與胃癌患者生存分析:通過生物信息分析在線網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter分析lncRNA HOXA-AS2對胃癌患者預(yù)后的影響,公共數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明,lncRNA HOXA-AS2高表達(dá)組的總生存期為30.2個月低于lncRNA HOXA-AS2低表達(dá)組的123.8個月,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1C)。
3.lncRNA HOXA-AS2 與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系:為探討胃癌組織中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2表達(dá)水平的臨床意義,根據(jù)胃癌組織中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)情況,將患者分為高表達(dá)組(n=25)和低表達(dá)組(n=20)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明,lncRNA HOXA-AS2的高表達(dá)水平與與胃癌分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)(P<0.05),但lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05,表1)。
表1 45例胃癌組織中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(n)
4.siRNA轉(zhuǎn)染效果:細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后,通過熒光定量PCR檢測lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平探究siRNA的轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果表明,Si1和Si2均能成功干擾HGC-27和MKN-45細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平(P<0.05,圖2)。
圖2 siRNA轉(zhuǎn)染后HGC-27和MKN-45細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)
5.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞增殖能力的影響:敲低lncRNA HOXA-AS2后利用CCK-8法檢測HGC-27和MKN-45細(xì)胞的增殖能力,與SiNC組比較,Si1組和Si2組HGC-27、MKN-45的細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05,圖3)。
圖3 敲減lncRNA HOXA-AS2后對HGC-27(A)和MKN-45(B)細(xì)胞增殖能力的影響
6.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞克隆形成能力的影響:NC組、Si1組和Si2組HGC-27細(xì)胞的克隆數(shù)目分別為321.00±32.15、70.00±3.30、135.00±9.26;NC組、Si1組和Si2組MKN-45細(xì)胞的克隆數(shù)目分別為395.00±23.90、106.50±11.52、190.00±18.38。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著減少HGC-27和MKN-45細(xì)胞的克隆集落數(shù)目(P<0.05,圖4)。
圖4 沉默lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞克隆能力的影響
7.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞遷移能力的影響:如劃痕實驗結(jié)果所示(圖5),NC組HGC-27和MKN-45細(xì)胞的遷移愈合率分別為69.12%±6.23%和57.38%±4.34%;HGC-27細(xì)胞Si1組和Si2組的細(xì)胞遷移愈合率分別為17.37%±2.18%和29.72%±3.36%;MKN-45細(xì)胞Si 1組和Si 2組的細(xì)胞遷移愈合率分別為13.55%±1.20%和24.89%±2.06%。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著降低HGC-27和MKN-45細(xì)胞的遷移(P<0.05)。
圖5 沉默 lncRNA HOXA-AS2后對HGC-27和MKN-45細(xì)胞遷移能力的影響
8.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲能力的影響:NC組HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲數(shù)分別為424.00±32.89和381.00±35.03;Si1組HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲數(shù)分別為68.00±5.70和97.00±8.58;Si2組HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲數(shù)分別為122.00±7.82和198.00±10.70。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著降低HGC-27和MKN-45細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05,圖6)。
圖6 沉默lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細(xì)胞侵襲能力的影響
近年來,胃癌的診療取得了很大的進(jìn)步,特別是以手術(shù)治療、化療、放療和新輔助化療為主的綜合治療的實施,早期胃癌患者的5年生存率已達(dá)到95%[12]。但由于胃癌早期缺乏典型的癥狀,大部分患者被診斷時已錯過手術(shù)治療的最佳時期,伴有局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者的5年生存率還不足20%[13]。當(dāng)前,針對晚期胃癌患者的治療主要以化療和靶向療法為主,然而藥物的毒性不良反應(yīng)以及耐藥性的產(chǎn)生往往導(dǎo)致晚期胃癌患者較差的預(yù)后和生活質(zhì)量的降低[14]。因此,闡明胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制,為胃癌患者尋求新的治療策略是極其必要的。
測序技術(shù)的進(jìn)步使得人們能夠更深入的進(jìn)行基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn),人類基因組只有不到2%的轉(zhuǎn)錄本可以翻譯成蛋白質(zhì),其余98%的轉(zhuǎn)錄本被稱為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)[15]。ncRNA雖然不編碼蛋白質(zhì),但其在細(xì)胞生物學(xué)活動中發(fā)揮著重要作用,長度超過200個核苷酸的ncRNA被稱為lncRNA[16]。越來越多的研究表明,lncRNA直接或者間接參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的分子機制,調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞信號通路,并表現(xiàn)出致癌或抑癌作用[15]。Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌中l(wèi)ncRNA HGBC的表達(dá)水平顯著上調(diào),高表達(dá)的lncRNA HGBC與患者的不良預(yù)后相關(guān),進(jìn)一步探究相關(guān)機制發(fā)現(xiàn),lncRNA HGBC可通過海綿化miR-502-3p繼而激活A(yù)kt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)膽囊癌的進(jìn)展。Dong等[18]利用微陣列對曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞及親代細(xì)胞進(jìn)行測序分析,結(jié)果表明lncRNA TINCR的表達(dá)水平在曲妥珠耐藥細(xì)胞系中顯著上調(diào),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TINCR不僅可以通過上調(diào)HER-2的表達(dá)來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥性的產(chǎn)生,其還可以靶向Snail-1誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)一步加強乳腺癌細(xì)胞對曲妥珠單抗的耐藥性。諸多報道證實,lncRNA HOXA-AS2在多種癌癥中失調(diào),其失調(diào)可促進(jìn)多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展,但lncRNA HOXA-AS2在胃癌中的表達(dá)水平及所發(fā)揮的作用目前仍不清楚。
本研究表明,與癌旁組織比較, lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著升高,提示其在胃癌中可能發(fā)揮致癌基因的作用,進(jìn)一步驗證lncRNA HOXA-AS2在人正常胃黏膜細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),lncRNA HOXA-AS2在人胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。通過在線生信網(wǎng)站分析了lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系,結(jié)果表明lncRNA HOXA-AS2低表達(dá)組的胃癌患者的總生存期要遠(yuǎn)長于lncRNA HOXA-AS2高表達(dá)組胃癌患者的生存期,提示lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平還與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。接下來分析了lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系,統(tǒng)計分析結(jié)果表明,lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平與與腫瘤分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān),而與患者的年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。進(jìn)一步探究了lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)的影響,并成功利用siRNA下調(diào)了胃癌細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA HOXA-AS2的表達(dá)。體外實驗結(jié)果表明,敲減lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)水平后,胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均被抑制,表明lncRNA HOXA-AS2在胃癌細(xì)胞中充當(dāng)促癌基因。
綜上所述,本研究初步證實lncRNA HOXA-AS2在胃癌中發(fā)揮促癌分子作用。lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)。lncRNA HOXA-AS2的高表達(dá)與胃癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、預(yù)后呈正相關(guān)。敲低lncRNA HOXA-AS2的表達(dá)后顯著抑制了胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,結(jié)果提示 lncRNA HOXA-AS2可能在胃癌中發(fā)揮促癌基因的作用,但lncRNA HOXA2促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機制還需開展進(jìn)一步研究予以證實。