黃凱,何啟杰,陳櫻,歐陽(yáng)康,黃偉堅(jiān),彭昊,韋祖樟,李軍*

(1.廣西獸醫(yī)研究所廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530005; 2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530005;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(guó)(廣西)-東盟跨境動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530005)

乳酸菌 (Lacticacidbacteria,LAB) 是人體及動(dòng)物體內(nèi)天然存在的對(duì)機(jī)體有益生作用的一種重要菌種,具有多種生物學(xué)功能,如調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道微生態(tài)平衡、降低血液膽固醇以及控制內(nèi)毒素等,因此被稱為益生菌[1, 2]。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L．lactis)是一種達(dá)到了食品級(jí)的乳酸菌,在乳酸菌屬中最為重要[3],近年來(lái)在食品加工及保健品行業(yè)被廣泛應(yīng)用,主要作用是參與調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群生態(tài)平衡[4]。21世紀(jì)以來(lái)分子生物學(xué)飛速發(fā)展,乳酸乳球菌的全基因組序列也逐步完成測(cè)定,對(duì)于乳酸乳球菌的研究取得了重大進(jìn)展,一些外源基因已被報(bào)道在乳酸菌中成功表達(dá)。例如,Renye等[5]通過(guò)乳酸鏈球菌素Nisin誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)獲得片球菌素;Abdullah等[6]在乳酸乳球菌NZ9000這一常用乳酸菌種中表達(dá)了大腸桿菌的熱休克蛋白DnaK。

纖維素酶(Cellulase)是一種可催化纖維素分解的酶類物質(zhì),廣泛存在于自然界的微生物及動(dòng)植物體內(nèi)。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來(lái)自木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)的真菌。纖維素酶是由內(nèi)切葡萄糖苷酶(又稱葡聚糖內(nèi)切酶)、外切葡萄糖苷酶(又稱葡聚糖外切酶、纖維二糖水解酶CBH)、 β-葡萄糖苷酶(又稱纖維二糖酶)3種不同催化功能的酶組成的多組分酶系,這三種酶互相協(xié)同作用增強(qiáng)了降解纖維素的效率[7]。纖維素酶的獲取主要來(lái)自動(dòng)物和微生物,這之中真菌類的木霉屬(Trichoderma)應(yīng)用最為廣泛,因?yàn)槠洚a(chǎn)生的酶量較大、活性較高且遺傳性狀穩(wěn)定。與此同時(shí),康寧木霉、綠色木霉、里氏木霉等真菌也在生產(chǎn)中應(yīng)用較廣。在20世紀(jì)80年代,DNA重組技術(shù)就已經(jīng)應(yīng)用在纖維素酶基因的克隆及其鑒定方面了,近年來(lái)關(guān)于真核表達(dá)系統(tǒng)的酵母表達(dá)系統(tǒng)研究較多,如劉澤寰等[8]將綠色木霉CBH Ⅱ基因表達(dá)于釀酒酵母,無(wú)須誘導(dǎo)即可產(chǎn)生分泌到胞外的纖維二糖水解酶。陳士華等[9]也成功通過(guò)畢赤酵母表達(dá)康寧木霉的CBH Ⅱ基因。隨后人們又將目光轉(zhuǎn)向了原核表達(dá)系統(tǒng),通過(guò)植物乳桿菌來(lái)表達(dá)纖維素酶[10]。如趙瑩等[11]構(gòu)建了重組酸性纖維素酶CBH Ⅱ基因與pW425t非抗性的穿梭表達(dá)載體的重組質(zhì)粒pW425t-CBH Ⅱ,通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入乳酸桿菌中,并且表達(dá)成功。孫磊等[12]將纖維素酶基因?qū)肴樗峋蝎@得了轉(zhuǎn)基因乳酸菌,得到了可分解含有纖維素和半纖維素物質(zhì)作物的新型青貯劑,使青貯更加方便高效。

本研究旨在將能降解纖維素酶系中的綠色木霉CBH II基因克隆到乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8148,通過(guò)電轉(zhuǎn)化方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入具有良好益生效果的乳酸乳球菌NZ3900中,經(jīng)Nisin誘導(dǎo)表達(dá),獲得能表達(dá)纖維素酶的重組乳酸乳球菌,為乳酸乳球菌的改造應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。對(duì)乳酸乳球菌進(jìn)行表達(dá)可分解纖維素酶基因的改造,可能獲得新型的青貯飼料添加劑,增加對(duì)飼料中纖維素和半纖維素物質(zhì)的分解,提高青貯效率,增加飼料的分解利用率;也可能開(kāi)發(fā)出新型的生物口服制劑,增加動(dòng)物體對(duì)富含纖維素和半纖維素物質(zhì)作物的消化與吸收,從而提高畜牧生產(chǎn)的效率。

1 材料與方法

1.1 所用質(zhì)粒和細(xì)胞

通過(guò)生物信息學(xué)方法按照乳酸菌的偏好性對(duì)綠色木霉(T.reesei)CBH II基因(GenBank登錄號(hào)：M55080)進(jìn)行密碼子優(yōu)化[13],進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的CBH II基因由北京擎科生物科技有限公司合成并克隆到克隆載體中,獲得質(zhì)粒pCBH II;乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8148來(lái)自廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所;MC1061大腸桿菌購(gòu)于湖南豐暉生物科技有限公司;乳酸乳球菌NZ3900來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR?MAX DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均購(gòu)于Takara公司;高保真限制性核酸內(nèi)切酶KpnI-HF和SacI-HF以及T4 DNA連接酶購(gòu)于New England BioLabs公司;膠回收試劑盒、反應(yīng)液回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)于Omega公司;超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司;GM17肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于北京酷來(lái)博科技有限公司;乳酸鏈球菌素(Nisin)購(gòu)于 MACKLIN公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于康為世紀(jì)公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)密碼子優(yōu)化后的綠色木霉(T.reesei)CBH II基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,上游引物引入KpnI限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn),下游引物引入SacI限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn),引物由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列為：

CBH II-KpnI-F：5′-acgGGTACCatgaagaaaaagatcatcagtg-3′(下劃線部分為KpnⅠ識(shí)別位點(diǎn));CBH II-SacI-R：5′-cgtGAGCTCtaaaaatgatggattcgcatt-3′(下劃線部分為SacⅠ識(shí)別位點(diǎn))。

1.4 CBH II基因的擴(kuò)增

將質(zhì)粒pCBH II稀釋1000倍后以其為模板,使用PrimeSTAR MAX高保真DNA聚合酶擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25μL體系：PrimeSTAR MAX 12.5μL,上下游引物分別0.5μL,模板DNA 3μL,ddH2O補(bǔ)全至25μL,配制兩管共50μL。PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性98℃ 3min;變性98℃ 10s,退火55℃ 5s,延伸72℃ 10s,32個(gè)循環(huán);繼續(xù)延伸72℃ 10min后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,目的條帶使用Omega公司膠回收試劑盒純化回收。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

使用NEB公司的限制性核酸內(nèi)切酶KpnI-HF和SacI-HF同時(shí)酶切pNZ8148和CBH II回收產(chǎn)物。分別配制50μL體系：KpnI-HF 1μL,SacI-HF 1μL,CutSmart Buffer 5μL,模板質(zhì)粒pNZ8148/CBH II回收產(chǎn)物 15μL,ddH2O補(bǔ)全至50μL;37℃作用6h以上,使用Omega公司反應(yīng)液回收試劑盒純化回收。二者回收產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶16℃過(guò)夜連接;使用上海生工生物工程股份有限公司購(gòu)買的超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒,按說(shuō)明書(shū)步驟制備MC1061感受態(tài)細(xì)胞,并將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至MC1061感受態(tài)細(xì)胞中,涂布含氯霉素抗性LA平板并挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定,陽(yáng)性克隆大量擴(kuò)繁菌液后使用Omega公司質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切與生物測(cè)序進(jìn)一步鑒定,獲得質(zhì)粒pNZ8148-CBH II。

1.6 乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞的制備

取-80℃儲(chǔ)存的NZ3900菌種加入5mL GM17液體培養(yǎng)基中,30℃靜置厭氧培養(yǎng)24h進(jìn)行活化,隨后按1∶20的比例將上述菌液加入10mL GM17液體培養(yǎng)基中,在30℃靜置厭氧培養(yǎng)24h放大培養(yǎng),取10mL菌液接種于100mL GM17液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至OD600≈0.3時(shí),于4℃ 4000r/min離心15min收集菌體沉淀,加入50mL 預(yù)冷的含0.5M蔗糖及10%甘油的溶液(EPB)洗滌菌體;通過(guò)4℃ 4000r/min離心15min收集沉淀,加入50mL預(yù)冷的含0.05M EDTA的EPB溶液再次洗滌菌體,4℃ 4000r/min離心15min收集沉淀,再次加入12mL預(yù)冷的EPB溶液洗滌菌體,4℃ 4000r/min離心15min,收集沉淀,最后加入適量的EPB溶液重選菌體,每管100μL 進(jìn)行分裝,-80℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.7 重組CBH II蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

利用鑒定正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化NZ3900感受態(tài)細(xì)胞,條件為電壓2500V、電阻200Ω,將所獲菌液涂布于含有氯霉素的GM17平板,挑選單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性菌液接種于5mL GM17液體培養(yǎng)基,并于30℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜(約16h);按 1∶25 的比例將菌液轉(zhuǎn)接至 10mL GM17 液體培養(yǎng)基中,待OD600達(dá)到0.4時(shí),加入乳酸鏈球菌素(Nisin)至終濃度20ng/mL置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置誘導(dǎo)5h。最后加入8mL PBS重懸菌體,超聲破碎菌體(300W,破碎3 s,間歇4 s,150次),5000r/min,4℃離心15min,分別收集上清和沉淀(包涵體)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,同時(shí)將空載pNZ8148作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148-CBH II的構(gòu)建與鑒定

以質(zhì)粒pCBH II為模板,用設(shè)計(jì)的引物CBH II-KpnI-F和CBH II-SacI-R擴(kuò)增CBH II基因,將擴(kuò)增的CBH II基因克隆至載體pNZ8148中,得到的重組質(zhì)粒命名為pNZ8148-CBH II。對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和SacⅠ 雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢出約1500bp的目的片段和pNZ8148載體片段(圖1),與預(yù)期大小一致,最后通過(guò)測(cè)序結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL5 000;1,2：pNZ8148-CBH II。

圖2 測(cè)序結(jié)果比對(duì)

2.2 重組質(zhì)粒pNZ8148-CBH II電轉(zhuǎn)化NZ3900陽(yáng)性克隆篩選

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pNZ8148-CBH II以電壓2500V、電阻200Ω的條件電轉(zhuǎn)化進(jìn)入NZ3900感受態(tài)細(xì)胞,將所獲菌液涂布于含有氯霉素的GM17平板,挑選單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆(圖3),結(jié)果顯示在1500bp處有符合其大小的特異性條帶,說(shuō)明電轉(zhuǎn)化成功。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1,2： pNZ8148-CBH II。

2.3 重組蛋白CBH II的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

取上述PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆接種于5mL GM17液體培養(yǎng)基,并于30℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜(約16h);按 1∶25 的比例將菌液轉(zhuǎn)接至10mL GM17 液體培養(yǎng)基中,待 OD600達(dá)到0.4時(shí),加入乳酸鏈球菌素(Nisin)靜置誘導(dǎo)5h。通過(guò)超聲破碎菌體,收集上清和沉淀(包涵體)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖4)。結(jié)果顯示,Nisin誘導(dǎo)的pNZ8148-CBH II菌液和菌液超聲沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳分析在約53kDa處有特異性條帶,符合預(yù)期大小,而pNZ8148空載、未誘導(dǎo)的pNZ8148-CBH II菌液以及菌液超聲上清均無(wú)條帶,說(shuō)明重組CBH II蛋白可經(jīng)Nisin誘導(dǎo)在NZ3900細(xì)胞中表達(dá),且以包涵體形式表達(dá)。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1：pNZ8148空載對(duì)照;2：pNZ8148-CBH II未誘導(dǎo)菌液對(duì)照;3：pNZ8148-CBH II誘導(dǎo)菌液;4：pNZ8148-CBH II超聲沉淀;5：pNZ8148-CBH II超聲上清。

3 討論

乳酸菌是一類對(duì)人體和動(dòng)物體有益的、重要的益生菌,具有對(duì)整個(gè)機(jī)體的胃腸道微生態(tài)平衡、降低血液膽固醇以及控制內(nèi)毒素等多種生物學(xué)功能。其中最重要的乳酸乳球菌更是食品級(jí)的安全微生物,在食品加工業(yè)、保健品行業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域已被廣泛研究與應(yīng)用。近年來(lái)已有報(bào)道多種外源基因已成功在乳酸菌中表達(dá)[5, 6, 15],揭開(kāi)了對(duì)乳酸菌的改造及應(yīng)用新篇章。

纖維素酶是一種生物催化物質(zhì),作用主要是促進(jìn)纖維素的分解,存在于動(dòng)植物體內(nèi)及微生物中。孫磊[12]、趙瑩[11]等先后成功通過(guò)乳酸菌表達(dá)纖維素酶獲得重組乳酸菌工程菌,為改造新型乳酸菌、研制新的生物制劑促進(jìn)纖維素的分解與吸收提供了有力論證。本研究將能降解纖維素酶系中的CBH II基因克隆到乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8148中,通過(guò)電轉(zhuǎn)化方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ3900中并進(jìn)行Nisin誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE鑒定重組乳酸乳球菌成功表達(dá)了CBH II基因,其表達(dá)形式為包涵體表達(dá)。對(duì)此可對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行分泌型優(yōu)化、降低誘導(dǎo)溫度,保證蛋白有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊、添加可溶性標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)以增加蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的可溶性,從而促進(jìn)外源蛋白的可溶性表達(dá)。乳酸菌作為食品級(jí)微生物,在表達(dá)過(guò)程中,如果同時(shí)使用食品級(jí)的載體及誘導(dǎo)物,便可直接制成口服制劑,從而免去了一些繁瑣的提取步驟及過(guò)程,大大降低了成本以及提高了安全性[16]。荷蘭NIZO研究所開(kāi)發(fā)的食品級(jí)誘導(dǎo)物Nisin誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng) ( The nisin controlledgene expression system,NICE ) 是目前乳酸菌最成熟的表達(dá)體系[17, 18],Nisin作為L(zhǎng)．lactis天然分泌的一種抗菌肽,已被大部分國(guó)家認(rèn)定為食品級(jí)的天然防腐劑[19]。本研究使用Nisin誘導(dǎo),表達(dá)菌種及誘導(dǎo)物均為食品級(jí),但所用載體pNZ8148的篩選抗性為氯霉素,這對(duì)于食品和醫(yī)藥保健等安全性要求較高的領(lǐng)域應(yīng)用會(huì)有所受限。今后使用食品級(jí)選擇標(biāo)記如營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)型選擇標(biāo)記、糖類利用選擇標(biāo)記、熱應(yīng)激抗性選擇標(biāo)記等[20, 21],使得表達(dá)系統(tǒng)所有構(gòu)成均為食品級(jí),以滿足食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的高安全性要求。