張愛輝,胡春波,魏偉,毛瑞峰,賈斌,王春仁,高俊峰*

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 161319;2.齊齊哈爾市龍沙動(dòng)植物園有限公司,黑龍江 齊齊哈爾 161002; 3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

槽盤吸蟲病,是由背孔科(Notocotylidae)槽盤屬(Ogmocotyle)吸蟲寄生于動(dòng)物小腸中所引起的一種吸蟲病。槽盤吸蟲感染的宿主范圍較廣,包括山羊、綿羊、黃牛等家畜,甚至一些野生的哺乳動(dòng)物[1,2]。動(dòng)物感染后會(huì)出現(xiàn)貧血、消瘦、腹瀉、出血性腸炎等癥狀,嚴(yán)重感染可引起死亡[3]。槽盤吸蟲病不僅給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)壓力,而且對(duì)野生動(dòng)物的生命健康存在著巨大的威脅。

有關(guān)研究顯示,已經(jīng)報(bào)道的槽盤吸蟲種類有鹿槽盤吸蟲(Ogmocotylesikae)、羚羊槽盤吸蟲(Ogmocotylepygargi)、唐氏槽盤吸蟲(Ogmocotyletangi)和小熊貓槽盤吸蟲(Ogmocotyleailuri)[4-7]。不同種類的槽盤吸蟲寄生的宿主也有所差異,如鹿槽盤吸蟲主要寄生于麝[8]、綿羊和山羊體內(nèi),羚羊槽盤吸蟲主要寄生于綿羊和山羊體內(nèi)[4],唐氏槽盤吸蟲寄生于小鹿體內(nèi)[6],而小熊貓槽盤吸蟲主要寄生于小熊貓?bào)w內(nèi)[9]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)槽盤吸蟲睪丸的形態(tài)與雄莖囊的位置作為槽盤吸蟲種類判定的依據(jù)。但目前有關(guān)小熊貓槽盤吸蟲的報(bào)道極少,僅在北京動(dòng)物園有小熊貓感染槽盤吸蟲的報(bào)道[9]。

近年來,分子生物學(xué)方法已成為物種鑒定中常用的有效方法[10]。核糖體DNA(rDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer region,ITS)被報(bào)道可作為良好的遺傳標(biāo)記基因,已經(jīng)廣泛地用于寄生蟲領(lǐng)域的蟲體鑒定及遺傳進(jìn)化分析[11]。因此,本研究擬對(duì)齊齊哈爾某動(dòng)物園小熊貓腸道內(nèi)分離的吸蟲通過形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定,并基于rDNA ITS-2序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,探討該吸蟲在復(fù)殖吸蟲中的分類地位。本研究為小熊貓槽盤吸蟲病的流行病學(xué)調(diào)查和分子鑒別診斷提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲體

蟲體采自黑龍江省齊齊哈爾某動(dòng)物園一例小熊貓死亡病例,剖檢時(shí)于腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量小型吸蟲,將蟲體收集后用生理鹽水反復(fù)沖洗,放在70%的酒精中固定,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

德式蘇木素染液采購于Biosharp 公司;dNTPs、Loading Buffer、瓊脂糖均采購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、加拿大樹膠、水楊酸甲酯。

1.3 蟲體裝片制備及形態(tài)學(xué)鑒定

將酒精中固定的蟲體取出,采用蘇木素染色的方法[12]經(jīng)染色,梯度酒精褪色,水楊酸甲酯透明,加拿大樹膠封固后制成裝片。將做好的裝片放于顯微鏡下,先通過低倍鏡觀察蟲體整體輪廓,再通過高倍鏡觀察蟲體的各個(gè)器官,特別注意蟲體的睪丸形態(tài)及雄莖囊的位置,參考先前文獻(xiàn)報(bào)道[4]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 DNA的提取及ITS序列分析

在70%酒精中取出蟲體,經(jīng)蒸餾水沖洗幾遍放置于無菌離心管中,利用DNA提取試劑盒提取此吸蟲總DNA,將提取的DNA存放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以所提取的DNA為模板,上游引物CPF：5′-CCCTGGAAACGGATTGT-3′,下游引物CPR：5′-ATGCTTGGGTCATAGAAA-3′,PCR擴(kuò)增目的序列。反應(yīng)體系為25μL;反應(yīng)條件：94℃ 2min,94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 80s,共35個(gè)循環(huán),72℃延伸7min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,將得到的目的條帶使用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收,送往測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將序列利用生物學(xué)軟件DNAStar 5.0,將兩段序列進(jìn)行拼接,與NCBI中相關(guān)吸蟲序列進(jìn)行比對(duì)分析,利用MEGA 11軟件將所得序列進(jìn)行分段。

1.5 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

以有尾感器亞綱的牛仰口線蟲(Bunostomumphlebotomum)為外群,將本研究所獲得的槽盤吸蟲與復(fù)殖吸蟲部分代表性吸蟲ITS-2序列進(jìn)行比對(duì)分析(表1)。使用MEGA 11軟件系統(tǒng)發(fā)育選項(xiàng)中的最大似然估計(jì)法(ML),substitution model、rates and patterns等選用默認(rèn)值,其中Bootstrap Replications改為500,來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,探討小熊貓槽盤吸蟲在復(fù)殖吸蟲中的分類地位。

表1 本研究進(jìn)化樹中復(fù)殖吸蟲ITS-2的序列信息

2 結(jié)果

2.1 吸蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)德式蘇木素染液染色后的蟲體裝片放在顯微鏡下進(jìn)行觀察,觀察結(jié)果顯示本研究分離的蟲體形態(tài)與文獻(xiàn)中小熊貓槽盤吸蟲的描述一致。蟲體小,呈卵圓形或葵花籽形,兩端鈍圓,口吸盤小,位于蟲體前端腹側(cè)面。無咽,食道短,兩腸支沿著身體兩側(cè)向后延伸至睪丸內(nèi)側(cè)。雄莖囊粗壯,呈半圓形橫臥在蟲體中央。沒有腹吸盤。子宮發(fā)達(dá),在蟲體的中后部,呈“S”狀彎曲。睪丸位于蟲體后側(cè),對(duì)稱分布,睪丸具有大量分葉,似香腸狀、不規(guī)則的卵圓形。梅氏腺位于兩睪丸之間。卵巢位于蟲體末端中央,分葉排布,每葉呈橢圓形(圖1)。因此,根據(jù)其形態(tài)要點(diǎn)將本研究分離的吸蟲鑒定為小熊貓槽盤吸蟲。

A：口吸盤;B：食道;C：雄莖囊;D：子宮;E：睪丸;F：梅氏腺;G： 卵巢。

2.2 rDNA ITS序列的擴(kuò)增及分析

通過PCR擴(kuò)增出小熊貓槽盤吸蟲的ITS序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在950bp左右出現(xiàn)單一條帶,與預(yù)期條帶大小一致(圖2)?；蚱谓?jīng)校正后進(jìn)行拼接,基因全長(zhǎng)為936bp,根據(jù)NCBI中相似序列進(jìn)行比對(duì)分析得出ITS-1、5.8S和ITS-2序列大小分別為518bp、126bp和292bp。將獲得的ITS-2序列與NCBI中Ogmocotylesikae(KF008246)的ITS-2序列進(jìn)行對(duì)比分析,二者同源性為94.9%(圖3),根據(jù)兩段序列對(duì)比有15個(gè)堿基發(fā)生了突變,即C49-T、T56-A、C84-T、G145-A、A158-G、A195-T、A217-G、C223-T、C230-T、C246-T、C247-T、A248-G、A262-G、A267-T、C277-T。

M：DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量;1：陰性對(duì)照;2-4：槽盤吸蟲樣本。

圖3 蟲體ITS-2基因相似性與分歧度分析

2.3 遺傳進(jìn)化分析

本研究以牛仰口線蟲作為外群,基于ITS-2序列采用最大似然法構(gòu)建復(fù)殖吸蟲系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。在系統(tǒng)發(fā)生樹中,本研究分離的槽盤吸蟲與槽盤屬的另兩種吸蟲O.capricorni和鹿槽盤吸蟲親緣關(guān)系最近,處于同一分支。其他背孔屬吸蟲與槽盤屬吸蟲均在背孔科分支中。背孔科、前后盤科、裂體科、后睪科、片型科形成單獨(dú)分支(圖4)。該結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致,表明ITS-2標(biāo)記的基因可以用來鑒定背孔科吸蟲的種間遺傳關(guān)系。

圖4 ML方法構(gòu)建復(fù)殖目吸蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

為了清楚地觀察到小熊貓槽盤吸蟲的內(nèi)部器官結(jié)構(gòu),本研究通過德氏蘇木素染色方法對(duì)槽盤吸蟲進(jìn)行染色。與槽盤屬已報(bào)道的鹿槽盤吸蟲、唐氏槽盤吸蟲和羚羊槽盤吸蟲的形態(tài)學(xué)要點(diǎn)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其睪丸的形態(tài)與雄莖囊的位置在各吸蟲間均有所差異,其中羚羊槽盤吸蟲的睪丸呈長(zhǎng)柱形且睪丸邊緣有多數(shù)分瓣,雄莖囊縱臥于蟲體前端。唐氏槽盤吸蟲的睪丸呈長(zhǎng)塊狀,邊緣有深淺不等的缺刻,雄莖囊位于蟲體前半部的右側(cè)。鹿槽盤吸蟲的睪丸呈長(zhǎng)橢圓形,邊緣有4～5個(gè)缺刻[13],雄莖囊也是縱臥于蟲體前端。而小熊貓槽盤吸蟲的睪丸大量分瓣且呈香腸狀,雄莖囊發(fā)達(dá)且橫臥于蟲體前半部。通過染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)從小熊貓?bào)w內(nèi)分離到的蟲體睪丸形態(tài)與雄莖囊位置與文獻(xiàn)描述一致,根據(jù)形態(tài)學(xué)確定此吸蟲為小熊貓槽盤吸蟲。

雖然在形態(tài)上可以簡(jiǎn)單快速地對(duì)槽盤吸蟲進(jìn)行種屬的鑒定。但是,蟲體間的形態(tài)差異以及鑒定人員的水平和經(jīng)驗(yàn)等因素影響著對(duì)蟲體鑒定的準(zhǔn)確性。所以就要借助分子生物學(xué)手段對(duì)所研究的槽盤吸蟲進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。ITS被廣泛地應(yīng)用于寄生蟲蟲種鑒定以及遺傳進(jìn)化分析中[14]。為了對(duì)槽盤吸蟲進(jìn)行種類鑒定及進(jìn)化分析,本研究擴(kuò)增其ITS基因序列并測(cè)序比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)此蟲體與O.capricori和鹿槽盤吸蟲的基因相似度分別為94.8%和94.9%,且在進(jìn)化樹中處于同一分支,由此可以表明此種吸蟲屬于槽盤屬吸蟲。另外,在槽盤屬吸蟲分支中,O.capricorni與鹿槽盤吸蟲聚在一起,較本研究分離的小熊貓槽盤吸蟲親緣關(guān)系要近。NCBI數(shù)據(jù)庫中O.capricorni與鹿槽盤吸蟲序列信息顯示兩種吸蟲的宿主分別為髭羚和山羊,宿主動(dòng)物均屬于偶蹄目?？?但本研究的槽盤吸蟲宿主動(dòng)物為小熊貓,屬于食肉目小熊貓科,這可能是出現(xiàn)上述進(jìn)化分析結(jié)果的重要原因。

本研究通過形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)黑龍江省某動(dòng)物園小熊貓?bào)w內(nèi)分離的吸蟲進(jìn)行鑒定,最終確定所分離的吸蟲為小熊貓槽盤吸蟲。該結(jié)果填補(bǔ)了槽盤吸蟲的分子數(shù)據(jù),為我國小熊貓槽盤吸蟲的流行病學(xué)調(diào)查及分子鑒別診斷提供科學(xué)的參考依據(jù)。