趙珈瑤 白辰

大量的臨床及文獻(xiàn)均證實(shí)多種肺組織炎癥損傷的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與以胃腸為代表的消化系統(tǒng)具有密切關(guān)系,這其中包括腸道內(nèi)的菌群?！帮L(fēng)溫外薄,肺胃內(nèi)應(yīng)”,腸道菌群在呼吸系統(tǒng)感染的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。麻杏石甘湯首見(jiàn)于張仲景的《傷寒論》,治療肺炎肺損傷確有療效,而麻杏石甘湯通過(guò)腸道菌群治療肺炎的機(jī)制尚不明確。本研究采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)霧化吸入法制備大鼠急性肺損傷模型,通過(guò)高通量測(cè)序和代謝組學(xué)檢測(cè)動(dòng)物腸內(nèi)容物,分析麻杏石甘湯干預(yù)后動(dòng)物腸道菌群和代謝產(chǎn)物的變化,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以期探討麻杏石甘湯治療肺炎時(shí)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝功能的分子基礎(chǔ)和機(jī)制,中醫(yī)以“麻杏石甘湯”為代表的相關(guān)方證理論提供實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康SPF雄性SD大鼠50只,3周齡,體質(zhì)量(110±10)g,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房。倫理批準(zhǔn)號(hào):bucm-4-2021090306-3125。

1.2 主要試劑

造模藥物:LPS(Sigma,057M4013V)。

中藥復(fù)方麻杏石甘湯參考《方劑學(xué)》(人民衛(wèi)生出版社),選用麻黃9 g、杏仁9 g、炙甘草6 g、生石膏18 g,制備麻杏石甘湯配方顆粒。配方顆粒夠自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。按人與大鼠0.018的等效劑量進(jìn)行換算。

對(duì)照藥物:莫西沙星(拜耳,J20150015)、醋酸潑尼松(天津天藥藥業(yè)股份有限公司,CP190611a)。

檢測(cè)試劑盒:γ干擾素(interferon-γ,INF-γ),購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司,貨號(hào)KE1431。丙二醛(malondialdehyde,MDA),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),一氧化氮(nitric oxide,NO),均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,貨號(hào)分別為A003-1、A001-3、A013-2-1。

1.3 分組與造模

動(dòng)物隨機(jī)分為5組,正常組、模型組、中藥組、抗生素組、激素組,每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后,模型組、中藥組、抗生素組和激素組予0.5 mg/mL的LPS霧化,每天30分鐘,連續(xù)3天。中藥組、激素組和抗生素組于第一次霧化結(jié)束后當(dāng)天分別予麻杏石甘湯和莫西沙星、醋酸潑尼松口服治療,每天灌胃1次,連續(xù)3天。按人與大鼠0.018的等效劑量進(jìn)行換算。

1.4 取材

末次治療結(jié)束后,禁食不禁水12小時(shí),然后予10%水合氯醛麻醉處死后,腹主動(dòng)脈取血,取部分肺組織福爾馬林浸泡后制備蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE),染色,取腸內(nèi)容物、部分肺組織于液氮速凍后,保存于-80℃冰箱備用。取肝、脾、腎(單側(cè))、胸腺稱重。

1.5 檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.5.1 病理染色 取福爾馬林浸泡的肺組織樣本,修塊后進(jìn)行石蠟包埋,切白片后,進(jìn)行HE染色。

1.5.2 腸道內(nèi)容物16S 使用宏基因組脫氧核糖核酸(DeoxyriboNucleic Acid,DNA)提取試劑盒提取腸內(nèi)容物中的總DNA;以細(xì)菌16S 核糖體核糖核酸(Ribosomal RNA,rRNA)基因的V3～V4可變區(qū)序列為靶標(biāo),以帶有標(biāo)簽(barcode)序列的338F-806R為引物,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR),獲取PCR產(chǎn)物;PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)定量及文庫(kù)構(gòu)建后,利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)堿基序列信息;利用QIIME 2.0軟件包,對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行OU(分類學(xué)操作單元)聚類,OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,獲取OTU對(duì)應(yīng)的分類單元(包括門綱目科屬種)及其相應(yīng)的豐度信息;計(jì)算Chao1、ACE、Shannon和Simpson等度量指數(shù),評(píng)估樣品中細(xì)菌菌群的豐富度和均勻度;綜合應(yīng)用PCA分析、Metastats分析、LEfSe分析、ANOVA方差分析等方法尋找各組中的特征菌。

1.5.3 腸道內(nèi)容物代謝產(chǎn)物 提取腸內(nèi)容物中的代謝物后,進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),通過(guò)Proteowizard軟件(v3.0.8789)將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式、利用R(v3.1.3)的XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊,得到包括質(zhì)核比和保留時(shí)間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣;進(jìn)而得到正負(fù)離子模式下的前體分子,導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Excel進(jìn)行后續(xù)分析。對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行QC質(zhì)量控制以及批次校正,數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后,統(tǒng)計(jì)代謝物含量,進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的降維分析,并對(duì)特征代謝進(jìn)行篩選及相關(guān)分析,最后完成特征代謝物的通路分析。

1.5.4 腸道內(nèi)容物16S與代謝組關(guān)聯(lián) 從Deseq2分析結(jié)果中提取P<0.05的細(xì)菌;提取組內(nèi)細(xì)菌豐度;提取差異顯著細(xì)菌組內(nèi)豐度。從T檢驗(yàn)分析結(jié)果中提取P<0.05的代謝物;提取組內(nèi)代謝物豐度;提取差異顯著代謝物組內(nèi)豐度。將差異顯著代謝物組內(nèi)豐度和差異顯著細(xì)菌組內(nèi)豐度整理到關(guān)聯(lián)分析文件夾中;用R corr.test函數(shù)組內(nèi)差異顯著代謝物與組內(nèi)差異顯著細(xì)菌的相關(guān)性,并進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)得到P值;用R pheatmap將相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理比較

由圖1可見(jiàn),經(jīng)LPS霧化干預(yù)后,動(dòng)物肺組織出現(xiàn)大面積的肺支氣管壁增厚和肺間質(zhì)的炎癥性物質(zhì)滲出。經(jīng)藥物干預(yù)后,肺組織炎癥呈現(xiàn)不同程度的吸收。其中抗生素組肺間質(zhì)、支氣管壁吸收情況較好,激素組和中藥組呈現(xiàn)相近程度的炎癥吸收效果。

注:A為正常組;B為模型組;C為中藥阻;D為抗生素組;E為激素組。

2.2 各組大鼠腸道菌群比較

經(jīng)對(duì)樣本OTU的分析,如圖2所示,三組共有物種581個(gè),在門水平上,模型組和中藥組種Firmicutes、WPS_2兩種菌的水平,與正常組有顯著上升;在科、屬水平中,與模型組和中藥組相比,正常組中呈優(yōu)勢(shì)菌的有Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Odoribacteraceae和Verrucomicrobiaceae;與正常組和中藥組相比,模型組中呈優(yōu)勢(shì)菌的有Porphyromonadaceae、Rikenellaceae和Turicibateraceae;與正常組和模型組相比,中藥組中呈優(yōu)勢(shì)菌的有Staphylococcaceae、Gemellaceae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae、Erysipelotrichaceae和Comamonadaceae。

注:A為門分類水平的熱圖;B為各個(gè)分組在門水平上的相對(duì)分布情況柱形圖(相對(duì)豐度前20的物種);C為L(zhǎng)EfSe分析LDA柱形圖;D為L(zhǎng)EfSe分析cladogram圖;E為共有或特有物種韋恩圖展示(當(dāng)分組數(shù)目小于等于5時(shí))。NC為正常組;MC為模型組;TC為中藥組。

2.3 各組大鼠腸道代謝物

如圖3所示,應(yīng)用單變量與機(jī)器學(xué)習(xí)分析,發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物經(jīng)中藥治療干預(yù)后,含量顯著下調(diào)的有磷酸酯、焦谷氨酸、β-酪氨酸、十二烷酸、1-甲基組氨酸、茶堿,含量顯著上調(diào)的有芥酸、琥珀酸半醛、二十碳二烯酸、山梨醇、17a雌二醇、4,5-二氫乳清酸、龍膽酸、D-甘露糖和脫氫表雄酮等。

注:A為代謝物差異箱式圖;B為隨機(jī)森林中最重要的15種代謝物;C為SVM中最重要的15種代謝物;D為SVM ROC曲線。NC為正常組;MC為模型組;TC為中藥組。

2.4 腸道菌群—代謝產(chǎn)物關(guān)聯(lián)分析

如圖4所示,在屬水平下,經(jīng)麻杏石甘湯干預(yù)后,腸道菌群中的Veilonella、Aerococcus等菌與磷酸氨基甲酸、琥珀酸半醛、維生素D2、棕櫚酸、馬來(lái)酸、磷酸、1-甲基組氨酸、3-脫氫莽草酸、二十碳二烯酸等呈正相關(guān),Alistipes、Parabacteroides等菌與維生素D2、馬來(lái)酸、磷酸等呈負(fù)相關(guān)。

注:由上至下依次為與正常組相比的模型組、與模型組相比的治療組、與正常組相比的治療組。

3 討論

麻杏石甘湯辛涼宣肺,清熱平喘?？v觀全方,石膏辛寒清熱,同歸肺胃兩經(jīng);苦杏仁止咳平喘,又兼潤(rùn)腸通便;甘草本為清熱解毒之品,火炙之后,功擅補(bǔ)脾和胃,三藥皆與陽(yáng)明有關(guān)。傷寒與明清溫病,雖一偏重扶陽(yáng)氣,一偏重存津液,但顧護(hù)中焦氣血生化之源,仍為臨床不可忽視的治療大法。麻杏石甘湯全方在清肺熱的同時(shí),無(wú)處不顧護(hù)中焦脾胃,即固其本,又既病防變,有防止肺熱順傳陽(yáng)明的作用。既往研究,多有“肺病看肺”的特點(diǎn),即肺炎的研究只聚焦于肺組織和外周血的炎癥反應(yīng),少有對(duì)于消化系統(tǒng)的研究。菌群作為消化系統(tǒng)的一部分,近年來(lái)研究熱度漸增?？诜o藥,多經(jīng)過(guò)藥物的吸收、分布、代謝及排泄過(guò)程,即ADME過(guò)程。中藥復(fù)方在口服后,也要經(jīng)由消化系統(tǒng),借助血液循環(huán),到達(dá)病灶的過(guò)程,因此腸道菌群是研究中藥復(fù)方藥理機(jī)制不可忽視的部分。中醫(yī)理論認(rèn)為的肺與大腸密切相關(guān),與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中的“腸—肺軸”具有相似的內(nèi)涵,課題組前期對(duì)“腸—肺軸”相關(guān)研究進(jìn)行了綜述,發(fā)現(xiàn)腸道菌群是多種呼吸系統(tǒng)疾病治療的重要著力點(diǎn)[1]。

目前,已有學(xué)者開(kāi)始探索麻杏石甘湯對(duì)腸道菌群的影響。如通過(guò)臨床研究,發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常規(guī)治療基礎(chǔ)上應(yīng)用麻杏石甘湯加減治療小兒支氣管哮喘急性發(fā)作期,可以改善患兒腸道菌群[2];而應(yīng)用麻杏石甘湯灌腸,可以更好地調(diào)整肺炎喘嗽患兒的腸道菌群結(jié)構(gòu)[3]。在機(jī)制探索方面,已有學(xué)者明確麻杏石甘湯可以改善流感病毒感染小鼠模型的腸道菌群結(jié)構(gòu)[4-5]。課題組前期對(duì)于麻杏石甘湯在肺損傷治療中的作用也進(jìn)行深入的了探討,我們首先從麻杏石甘湯中鑒定出97種成分[6],這些成分與麻杏石甘湯的共煎過(guò)程有關(guān)。然后我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了這些成分的作用機(jī)制,并結(jié)合肺組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了驗(yàn)證。其次,我們發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)通路預(yù)防細(xì)胞因子風(fēng)暴和緩解肺損傷。麻杏石甘湯臨床治療病毒性肺炎療效明確[7],如SARS、COVID-19、社區(qū)獲得性肺炎的臨床指南均指出,在臨床治療期時(shí)以麻杏石甘湯加減治療。且治療COVID-19的“三方三藥”中,除血必凈注射液外,均含有麻杏石甘湯。因此,我們也用甲型H1N1流感病毒株A/PR/8/34感染小鼠模型,探討了麻杏石甘湯治療病毒性肺炎的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)抑制肺組織糖酵解過(guò)程以及糖酵解驅(qū)動(dòng)的促炎巨噬細(xì)胞活化,從而抑制肺組織過(guò)度炎癥反應(yīng),減輕病毒性肺炎肺損傷[8]。但是目前的研究,均尚未涉及到麻杏石甘湯如何通過(guò)腸道菌群發(fā)揮治療效果。由本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,麻杏石甘湯對(duì)肺組織的炎癥損傷確有療效,其機(jī)制與通過(guò)腸道菌群,調(diào)節(jié)腸道代謝產(chǎn)物具有一定的相關(guān)性。

在腸道菌群與16S關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果中,可以發(fā)現(xiàn)在“屬”層面(Genus),韋氏菌屬(Veillonella)與棕櫚油酸(Palmitoleic acid)、馬來(lái)酸(Maleic acid)、磷酸(Phosphoglycolic acid)、1-甲基組氨酸(1-Methylhistidine)和3-脫氫莽草酸(3-Dehydroshikimic acid)均存在顯著的正相關(guān)性,而腸道菌群中韋氏菌屬的豐度在治療后呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),即麻杏石甘湯可以通過(guò)增加韋氏菌屬的豐度,增加這些代謝產(chǎn)物在腸道內(nèi)的含量。韋氏菌屬(Veillonella)是革蘭氏陰性厭氧性微小球菌,直徑0.3～0.5 μm,會(huì)積極發(fā)酵發(fā)酵丙酮酸、乳酸、蘋(píng)果酸、富馬酸和草酰乙酸。該均屬在動(dòng)物和人的自然腔道中大量存在,是分布于口腔、咽部、呼吸道、消化道的常見(jiàn)菌群。近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn)韋氏菌屬對(duì)人類感染和免疫發(fā)育過(guò)程具有重要影響。有研究支出,Veillonella parvula可能在兒童早期免疫系統(tǒng)發(fā)育中起到保護(hù)作用和幫助作用。對(duì)嬰兒的流行病學(xué)研究表明,Veillonella parvula的存在與哮喘、毛細(xì)支氣管炎和自閉癥呈負(fù)相關(guān)。在有哮喘風(fēng)險(xiǎn)的兒童中,腸道中相對(duì)豐富的細(xì)菌屬Veillonella的相對(duì)豐度顯著降低。而韋氏菌代謝的產(chǎn)物,均有一定的調(diào)節(jié)人體免疫狀態(tài)、恢復(fù)炎癥的作用。如棕櫚油酸可以調(diào)節(jié)身體代謝,影響炎癥標(biāo)記物和PPAR代謝通路,起到治療炎癥的作用[9];馬來(lái)酸可以通過(guò)下調(diào)ROS誘導(dǎo)的核因子-κB以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-6、環(huán)氧合酶-2和腫瘤壞死因子-α)的表達(dá),并抑制絲裂原活化蛋白激酶/活化蛋白1信號(hào)通路,降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),從而達(dá)到治療炎癥的目的[10];磷酸及其多種復(fù)合成分均具有一定抗炎作用,如磷酸鈉、磷酸奧司他韋等。

綜述所述,本研究發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯可能是通過(guò)增加韋氏菌屬豐度,進(jìn)一步調(diào)整腸道菌群內(nèi)棕櫚油酸、馬來(lái)酸、磷酸等代謝產(chǎn)物,進(jìn)而發(fā)揮治療肺損傷的作用。但是,本研究尚缺乏代謝產(chǎn)物針對(duì)肺組織代謝過(guò)程影響,未來(lái)將繼續(xù)深入探索?？傊?在中醫(yī)整體觀指導(dǎo)下,深入探索麻杏石甘湯等經(jīng)典復(fù)方治療呼吸系統(tǒng)疾病的科學(xué)內(nèi)涵,即增加了中醫(yī)藥的解釋能力與對(duì)話能力,也為相關(guān)疾病的治療和藥物研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。