王雁, 李振宇

1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院手術(shù)室,湖南衡陽421001;2.衡南縣人民醫(yī)院,湖南衡陽421199

B群腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis serogroup B,MenB)可穿過鼻黏膜屏障,在血液中大量繁殖,引起流行性腦脊髓膜炎(流腦)。研究指出,針對(duì)呼吸道傳染性疾病,黏膜免疫為更有效的免疫方式,因此研發(fā)安全高效黏膜疫苗對(duì)流腦的預(yù)防具有重要意義[1-3]。

CpG的寡脫氧核糖核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotides,CpG-ODN)作為黏膜免疫佐劑可上調(diào)共刺激分子表達(dá),誘發(fā)機(jī)體的系統(tǒng)免疫和黏膜免疫,但生物穩(wěn)定性不佳、易被核酸酶降解,需有效的載體來提高其穩(wěn)定性和有效性[4-5]。殼聚糖納米顆粒(chitosan nanoparticles,Chi NP)為黏膜疫苗載體,可促進(jìn)抗原吸收并提呈給抗原提呈細(xì)胞,引起黏膜免疫反應(yīng)[6]。研究證實(shí),B群腦膜炎奈瑟菌0315(Neisseria meningitides serogroup B 0315,NMB0315)為MenB疫苗的候選抗原[7]。本研究制備黏膜免疫佐劑Chi-CpG NP,檢測其對(duì)重組NMB0315(recombinant NMB0315,rNMB0315)蛋白的免疫效果。

1 材料和方法

1.1 材料

MenB標(biāo)準(zhǔn)株(MC58)來源于美國ATCC公司;E.coli BL21重組表達(dá)菌(pET-30a/NMB0315)由本實(shí)驗(yàn)室保存;140只3～4周齡雌性BALB/c小鼠[體質(zhì)量(16±2.1)g]來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。佐劑Chi NP溶液由廣漢恒宇新材料有限公司惠贈(zèng);CpG-ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT)由上海生工合成;辣根過氧化物標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購自美國Proteintech公司,細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)及IL-17A試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.2 蛋白疫苗的制備

將保存的pET-30a/NMB0315擴(kuò)增培養(yǎng),1.0 mmol/L IPTG,30 ℃,搖床,180 r/min,誘導(dǎo)表達(dá)6 h,NMB0315蛋白采用Ni-NTA親和層析法進(jìn)行純化,BCA法定量,SDS-PAGE分析純度。

1.3 Chi-CpG NP懸液的制備和安全性分析

將1 500 μg CpG-ODN溶于0.01 mol/L硫酸鈉溶液配制成1 500 mg/L溶液;取等量Chi NP溶液和CpG-ODN溶液于55 ℃水浴30 min;隨后將Chi NP加入到CpG-ODN溶液中,渦流震蕩30 s,室溫靜置30 min,制備Chi-CpG NP懸液。聚合物分散指數(shù)(polydispersity index,PDI)及Zeta電位由Zetasizer電位儀測定。透射電子顯微鏡下觀察Chi-CpG NP形態(tài),測定上清中游離的蛋白含量評(píng)價(jià)其吸附蛋白的能力。

將40只雌性BALB/c小鼠于SPF環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7天,隨機(jī)分為PBS組、CpG組、Chi NP組、Chi-CpG NP組,每組10只。PBS組采用20 μL PBS,CpG組采用15 μg CpG,Chi NP組采用20 μL Chi NP,Chi-CpG NP組采用15 μg Chi-CpG NP,各組均每天滴鼻1次,連續(xù)7天,各組小鼠滴鼻免疫液體的終體積為20 μL。每天稱量各組小鼠體質(zhì)量,第8天取各組小鼠肺組織HE染色,觀察炎癥反應(yīng)的程度評(píng)價(jià)佐劑對(duì)免疫小鼠肺組織的影響。

1.4 動(dòng)物免疫和標(biāo)本收集

將100只BALB/c小鼠隨機(jī)分為PBS組、rNMB0315組、rNMB0315+CpG組、rNMB0315+Chi NP組、rNMB0315+Chi-CpG NP組,每組20只。PBS組采用20 μL PBS,rNMB0315組采用30 μg rNMB0315,rNMB0315+CpG組采用30 μg rNMB0315+15 μg CpG,rNMB0315+Chi NP組采用30 μg rNMB0315+20 μL Chi NP,rNMB0315+Chi-CpG NP組采用30 μg rNMB0315+含15 μg Chi-CpG NP處理小鼠,各組小鼠滴鼻免疫液體的終體積為20 μL。各組小鼠經(jīng)乙醚麻醉后分別在第0、7、14、21天經(jīng)鼻腔免疫。收集第0、7、14、21、42天小鼠血液;收集第42天小鼠陰道灌洗液及鼻腔灌洗液;第42天無菌獲取脾臟,于超凈工作臺(tái)中制成單個(gè)細(xì)胞懸液。

1.5 Chi-CpG NP輔佐的rNMB0315疫苗免疫活性檢測

1.5.1 體液免疫檢測 rNMB0315蛋白包被ELISA板,取第42天小鼠陰道灌洗液、鼻腔灌洗液或取第0、7、14、21、42天血清作為一抗,間接ELISA法檢測小鼠sIgA水平、總IgG及亞類,酶標(biāo)儀讀取450 nm處光密度(optical density,OD)值。

1.5.2 細(xì)胞免疫檢測 將上述收集的淋巴細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)并將細(xì)胞調(diào)整至6.0×106個(gè)/mL,1 mL/孔加至細(xì)胞培養(yǎng)板中,rNMB0315蛋白刺激,于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h,吸出上清,ELISA檢測IL-4、IFN-γ、IL-17A水平。

1.5.3 疫苗的免疫保護(hù)效果觀察和免疫血清體外殺菌活性實(shí)驗(yàn) 免疫42天后,各組小鼠腹腔注射致死劑量MC58[7]后,并觀察小鼠14天內(nèi)存活情況。刮取MC58菌苔配制成4×103個(gè)/mL菌液。再將菌液與補(bǔ)體等體積混勻。待測血清56 ℃ 40 min滅活,用無菌PBS按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀釋。將12.5 μL菌液與12.5 μL補(bǔ)體(人血清)混合再與25 μL稀釋的待檢血清混合,37 ℃溫育1 h。將混合物均勻涂布于巧克力瓊脂培養(yǎng)平板,37 ℃ 5%CO2過夜培養(yǎng)。設(shè)置陽性對(duì)照組(診斷血清)、陰性對(duì)照(包括滅活補(bǔ)體+菌液、血清+滅活補(bǔ)體+菌液、補(bǔ)體+菌液)。血清體外殺菌活性用于評(píng)估腦膜炎球菌疫苗的保護(hù)效力。分別以陰性對(duì)照和陽性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果,抑制50%腦膜炎奈瑟菌菌量生長的血清最大稀釋度的倒數(shù)為小鼠血清殺菌抗體滴度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism8軟件分析。組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白的鑒定

純化分析結(jié)果顯示,得到與rNMB0315相對(duì)分子質(zhì)量46 kDa相符的目的條帶(圖1)。

圖1 rNMB0315蛋白鑒定結(jié)果M為Marker;1為E.coli BL21;2、3為純化的rNMB0315。

2.2 Chi-CpG NP特性檢測

2.2.1 Chi-CpG NP形態(tài)及吸附能力 成功制備Chi-CpG NP。Chi-CpG NP形態(tài)與Chi NP相似,類似球形,大小均一,分散均勻,未出現(xiàn)明顯的聚集。Chi-NP、Chi-CpG NP納米顆粒均具有較好的蛋白吸附特性,吸附率分別為(91.5±8.5)%、(85.5±8.2)%,但差異無顯著性(P>0.05;圖2)。

圖2 Chi-CpG NP形態(tài)及吸附能力A為Chi NP和Chi-CpG NP外形(透射電子顯微鏡);B為Chi NP和Chi-CpG NP對(duì)rNMB0315的吸附率。

2.2.2 Chi-CpG NP的理化性質(zhì) Chi NP、Chi-CpG NP納米顆粒粒徑120～150 nm、表面電位10～15 mV、PDI均小于0.5,結(jié)果證明CpG-ODN裝載到Chi NP對(duì)其理化性質(zhì)影響較小。

2.2.3 Chi-CpG NP免疫安全性評(píng)估 各組小鼠連續(xù)7天體質(zhì)量穩(wěn)步增長,且增長曲線近似,但組內(nèi)及組間差異均無顯著性(P>0.05);HE結(jié)果顯示,4組小鼠肺組織可見完整的肺泡,僅有輕微的白細(xì)胞浸潤(圖3)。

圖3 Chi-CpG NP安全性評(píng)估A為各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(200×);B為各組小鼠體質(zhì)量變化。

2.3 Chi-CpG NP輔佐的rNMB0315疫苗的免疫活性

2.3.1 體液免疫應(yīng)答 從第7天開始,各免疫組IgG、IgG1、IgG2a隨著時(shí)間遞增而升高,并且在第42天達(dá)峰值(P<0.05)。在第21、42天時(shí),IgG、IgG1、IgG2a rNMB0315+CpG組、rNMB0315+Chi-NP組、rNMB0315+Chi-CpG NP組高于rNMB0315組(P<0.05);rNMB0315+Chi-CpG NP組高于rNMB0315+CpG組和rNMB0315+Chi-NP組(P<0.05;圖4)。

圖4 不同時(shí)間免疫后特異性體液免疫應(yīng)答a為P<0.05,與同組7天比較;b為P<0.05,與同組14天比較;c為P<0.05,與同組21天比較;d為P<0.05,與rNMB0315組同時(shí)間比較;e為P<0.05,與rNMB0315+CpG組和rNMB0315+Chi NP組同時(shí)間比較。

2.3.2 黏膜免疫應(yīng)答 第42天時(shí),小鼠鼻腔灌洗和陰道灌洗液中特異性sIgA水平rNMB0315+Chi-CpG NP組、rNMB0315+Chi-NP組明顯高于rNMB0315組(P<0.05),rNMB0315+Chi-CpG NP組高于rNMB0315+CpG組和rNMB0315+Chi NP組(P<0.05;圖5)。

圖5 免疫42天后特異性黏膜免疫應(yīng)答a為P<0.05,與rNMB0315組比較;b為P<0.05,與rNMB0315+CpG組和rNMB0315+Chi NP組比較。

2.3.3 各組小鼠細(xì)胞免疫水平比較 免疫后42天,rNMB0315+CpG組IFN-γ水平高于rNMB0315組(P<0.05);IL-4、IFN-γ、IL-17A水平rNMB0315+Chi-NP組、rNMB0315+Chi-CpG NP組高于rNMB0315組(P<0.05);rNMB0315+Chi-CpG NP組高于rNMB0315+CpG組和rNMB0315+Chi NP組(P<0.05;圖6)。

圖6 各組小鼠細(xì)胞免疫水平比較a為P<0.05,與rNMB0315組比較;b為P<0.05,與rNMB0315+CpG組和rNMB0315+Chi NP組比較。

2.4 Chi-CpG NP輔佐的rNMB0315疫苗免疫保護(hù)效果

3天內(nèi)rNMB0315+Chi-CpG NP組、rNMB0315+Chi-NP組、rNMB0315+CpG組、rNMB0315組小鼠存活率分別為80%、70%、50%、40%(圖7)。免疫第42天,rNMB0315+Chi-CpG NP組小鼠免疫血清殺菌抗體滴度為1∶4,其他免疫組為1∶2。

圖7 各組疫苗免疫小鼠MC58攻擊后的存活率

3 討 論

腦膜炎球菌主要通過呼吸道感染,誘導(dǎo)呼吸道黏膜免疫可有效抵御腦膜炎球菌侵襲[1,8]。高效的黏膜免疫能提高抗原的免疫原性,刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答[9]。研究表明,納米顆粒誘導(dǎo)機(jī)休產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答[10-11]。Sadati等[12]發(fā)現(xiàn),Chi-CpG能顯著增強(qiáng)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫從而降低小鼠死亡率。本研究結(jié)果顯示,Chi-CpG NP輔佐rNMB0315滴鼻免疫小鼠,可使小鼠機(jī)體免疫效果增強(qiáng),小鼠的存活率提高。

研究證實(shí),粒徑在100～500 nm的納米顆粒可有效穿過黏膜屏障,使抗原有效地被抗原提呈細(xì)胞攝取[13]。本研究所合成的Chi-CpG NP粒徑120～150 nm,可遞送抗原至免疫細(xì)胞,改善抗原穩(wěn)定性并加強(qiáng)其免疫原性;安全性評(píng)估實(shí)驗(yàn)證實(shí)未導(dǎo)致小鼠肺部發(fā)生炎癥改變,安全性良好。評(píng)估腦膜炎球菌疫苗有效性的重要指標(biāo)是血清學(xué)保護(hù)效力[14-15]。本研究檢測結(jié)果顯示,Chi-CpG NP輔佐rNMB0315誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平顯著提升,其原因是CpG-ODN不穩(wěn)定容易被核酸酶降解,而Chi NP能使CpG-ODN有效遞送,并被抗原提呈細(xì)胞有效識(shí)別,從而激發(fā)免疫應(yīng)答[16]。

腦膜炎球菌感染機(jī)體首先在鼻黏膜黏附定植[17],而sIgA是黏膜抗感染免疫應(yīng)答中的主要保護(hù)因子,具有抗病原菌定植的作用,能中和病原體的毒力分子[18]。本研究結(jié)果顯示,Chi-CpG NP輔佐的rNMB0315疫苗可有效誘導(dǎo)局部和遠(yuǎn)端黏膜免疫應(yīng)答。黏膜表面豐富的Th17細(xì)胞刺激輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生sIgA;Th17細(xì)胞分泌IL-17A可有效抵御經(jīng)黏膜系統(tǒng)入侵的微生物[19]。Li等[20]證實(shí),IL-17A在抵御呼吸道病原體鸚鵡熱衣原體感染中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示,Chi-CpG NP輔佐的rNMB0315疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的IL-17A。

綜上,本研究成功制備了Chi-CpG NP。Chi-CpG NP能增強(qiáng)rNMB0315蛋白的免疫效果,提高小鼠的存活率。