吳松, 唐海林

中山大學腫瘤防治中心,廣東廣州510060

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性人群發(fā)病率最高的腫瘤,嚴重威脅著全球女性的健康[1]。三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中復發(fā)、轉移和死亡率最高的亞型,在BC中所占比例為10%～20%[2]。TNBC的特征為不表達雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2);由于TNBC特殊的分子分型,TNBC對內(nèi)分泌治療或分子靶向治療并不敏感[3]。由于目前仍缺乏有效的TNBC治療方案,早期發(fā)現(xiàn)和有效的靶向治療對于TNBC患者尤為重要。

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是以共價鍵形式形成閉合的環(huán)狀結構單鏈RNA,缺乏5′端帽子和3′poly(A)尾,被證實可參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程,包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和腫瘤等[4-5]。研究表明,環(huán)狀RNA的異常表達可通過影響TNBC細胞的增殖、凋亡、轉移和耐藥等過程,最終調(diào)控TNBC的進程[6]。因此,環(huán)狀RNA可能是TNBC潛在的生物標志物或治療靶點。本文主要闡述了環(huán)狀RNA的形成、作用機制和對TNBC潛在的臨床意義,為未來的臨床應用提供有效的信息。

1 環(huán)狀RNA的形成

與信使RNA(messenger RNA,mRNA)的線性剪接相比,環(huán)狀RNA的形成主要依賴于前體mRNA的反向剪接機制,即前體mRNA下游5′剪接位點(剪接供體)與上游3′剪接位點(剪接受體)通過3′-5′磷酸二酯鍵連接形成反向剪接位點[7]。根據(jù)組成成分的不同,環(huán)狀RNA可分為外顯子環(huán)狀RNA(exonic circRNA,ecircRNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA(circular intronic RNA,ciRNA)、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA(exonic-intron circRNA,EIciRNA)和融合基因來源的環(huán)狀RNA等4種類型[8]。研究表明,4種環(huán)化機制與ecircRNA和EIciRNA的生成相關,包括內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化、套索驅(qū)動環(huán)化、依賴RNA結合蛋白(RNA-binding-protein,RBP)驅(qū)動環(huán)化和依賴小核核糖核蛋白驅(qū)動環(huán)化機制[6]。ciRNA主要的產(chǎn)生機制是,反向互補的特定內(nèi)含子配對環(huán)化形成含有3′-5′磷酸二酯鍵的RNA套索,隨后切除3′尾巴并形成ciRNA。ciRNA和EIciRNA定位在細胞核中。環(huán)狀RNA如何從細胞核運輸至細胞質(zhì)中的機制尚不明確。此外,m6A修飾也被報道會影響環(huán)狀RNA的核輸出[9]。環(huán)狀RNA的閉合環(huán)狀結構可以有效抵抗核酸外切酶的降解,所以比線性RNA擁有更長的半衰期[10]?？傊?環(huán)狀RNA的穩(wěn)態(tài)豐度是生成效率、核輸出率和降解率三者平衡的結果。

2 環(huán)狀RNA的作用機制

研究表明,環(huán)狀RNA在基因表達的過程中具有重要作用[11]。環(huán)狀RNA可調(diào)控轉錄和剪接、作為微小RNA(microRNA,miRNA)海綿、與蛋白質(zhì)結合以及作為翻譯模板,進而影響基因表達。

2.1 調(diào)控轉錄和剪接

環(huán)狀RNA可參與轉錄和選擇性剪接的調(diào)控過程。位于細胞核中的ciRNA和EIciRNA可通過結合RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)復合體調(diào)控基因表達。circANKRD52和circSIRT7聚集在其轉錄位點,通過與RNA Pol Ⅱ復合物相互作用從而上調(diào)親本基因的轉錄[12]。Guarnerio等[13]發(fā)現(xiàn),circPOK在細胞核中結合并激活LIF2/3復合體,從而在間充質(zhì)腫瘤中發(fā)揮促癌作用。研究表明,剪接因子可調(diào)控環(huán)狀RNA的生成和選擇性剪接之間的平衡[14]。circMBL由MBL基因的第2外顯子反向剪接生成,該過程與MBL的選擇性剪接互相競爭。circMBL和circMBL的側翼內(nèi)含子均具有保守的MBL蛋白結合位點,這些位點可被MBL牢固而特異地結合。高表達的MBL與circMBL側翼內(nèi)含子結合,促進circMBL的反向剪接而抑制MBL mRNA的表達,同時circMBL也會與增加的MBL結合,使其含量趨于穩(wěn)定[14]。

2.2 與miRNA結合

環(huán)狀RNA可通過作為miRNA海綿參與轉錄后的基因調(diào)控。miRNA通過與mRNA 3′非編碼區(qū)堿基直接配對,降低mRNA穩(wěn)定性和抑制翻譯,從而負性調(diào)控mRNA的基因表達。環(huán)狀RNA含有不同類型的miRNA反應元件,可通過堿基互補配對原則競爭性結合miRNA,解除miRNA對靶基因的抑制作用,進而上調(diào)靶基因的表達,即形成circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控軸;該作用機制研究最充分的例子是環(huán)狀RNA CDR1as,它與miR-7有70多個保守的結合位點,并被miRNA結合蛋白AGO蛋白緊密結合[15]。劉睿涵等[16]報道,環(huán)狀RNA結合miRNA后在乳腺癌腦轉移中發(fā)揮關鍵性作用。本團隊近期發(fā)現(xiàn),circROBO1通過競爭性結合miR-217-5p上調(diào)KLF5的表達,形成circROBO1/miR-217-5p/KLF5調(diào)控軸,并通過抑制BECN1的轉錄進而抑制afadin的選擇性自噬[17]。

2.3 與蛋白質(zhì)結合

環(huán)狀RNA具有RBP的結合位點,可通過與蛋白質(zhì)相互作用來發(fā)揮功能。環(huán)狀RNA不僅可作為支架將不同蛋白質(zhì)招募或阻滯到特定亞細胞器,也可與其他RNA和蛋白質(zhì)形成復合物,從而調(diào)節(jié)信號通路。環(huán)狀RNA FECR1與TET1結合并可招募到FLI1的啟動子區(qū)域,還可結合并下調(diào)DNMT1,最終導致CpG島的DNA去甲基化并激活FLI1轉錄[18]。位于細胞質(zhì)中的circFoxo3與抗衰老蛋白ID1、E2F1以及抗應激蛋白FAK、缺氧誘導因子-1α相互作用,阻止這些蛋白進入細胞核,使其滯留在細胞質(zhì)中,從而促進細胞衰老和應激[19]。研究表明,circFoxo3能夠結合CDK2和p21,形成circFoxo3-p21-CDK2三元復合物,阻斷細胞由G1期進入S期,從而阻斷細胞周期進程[20]。環(huán)狀RNA也可以作為競爭元件阻斷RBP功能。位于細胞質(zhì)的circPABPN1可通過與RBP HuR結合,阻斷HuR與PABPN1 mRNA結合,進而抑制PABPN1的蛋白翻譯過程[21]。

2.4 作為翻譯模板

環(huán)狀RNA具有翻譯成蛋白質(zhì)或者多肽的潛能。一些具有內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)的環(huán)狀RNA可以利用起始密碼子,以不依賴帽子結構的方式進行翻譯。本團隊發(fā)現(xiàn),circFBXW7不僅作為內(nèi)源競爭RNA競爭性結合miR-197-3p而抑制TNBC生長,還可翻譯一種新型蛋白FBXW7-185aa,FBXW7-185aa蛋白可增加FBXW7的豐度和促進c-Myc降解,最終抑制TNBC細胞的增殖和轉移[22]。不依賴于帽子結構的蛋白翻譯是低效的,但是在饑餓和熱休克等壓力條件下,環(huán)狀RNA的翻譯效率得到提升[23]。此外,m6A修飾也可啟動環(huán)狀RNA翻譯。Wen等[24]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA富集m6A motif,且一個m6A位點就能夠啟動翻譯的起始過程。m6A啟動的翻譯需要起始因子eIF4G2和m6A識別蛋白YTHDF3,同時能被甲基轉移酶METTL3/14加強,能被去甲基化酶FTO抑制,也能被激活上調(diào)。該團隊進一步發(fā)現(xiàn),m6A驅(qū)動的環(huán)狀RNA翻譯廣泛存在,有數(shù)百個內(nèi)源性環(huán)狀RNA都具有翻譯潛能[24]。

3 環(huán)狀RNA在TNBC的生物學功能

隨著高通量測序和芯片技術的高速發(fā)展,越來越多環(huán)狀RNA在TNBC中的功能和潛在機制被報道。環(huán)狀RNA通過直接或間接調(diào)控腫瘤相關信號通路,在TNBC腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、凋亡、自噬、血管生成和化療耐藥等方面發(fā)揮重要作用[25]。

3.1 調(diào)控TNBC腫瘤細胞的增殖

環(huán)狀RNA可作為促癌或抑癌分子參與TNBC腫瘤細胞的增殖和生長過程。上調(diào)的環(huán)狀RNA一般被認為是促進腫瘤發(fā)生、細胞增殖、侵襲和轉移的促癌基因,同時可以抑制細胞周期和凋亡。研究發(fā)現(xiàn),circGFRA1、circEPSTI1、circKIF4A、circRAD18、circPLK1和circGNB1在TNBC細胞和組織中均上調(diào)[26],能夠在小鼠體內(nèi)外研究中促進細胞增殖和腫瘤生長。circ_0004676通過miR-377-3p/E2F6/PNO1軸在體外實驗可顯著加速細胞周期,促進TNBC細胞的增殖和遷移,在小鼠體內(nèi)試驗可促進腫瘤的生長和轉移[27]。circSEPT9在TNBC組織中表達上調(diào),與較差的臨床分期和預后相關。E2F1和EIF4A3介導生成的circSEPT9可通過miR-637的海綿調(diào)控LIF的表達,激活LIF/STAT3信號通路,從而促進TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制TNBC細胞凋亡和自噬[28]。

3.2 調(diào)控TNBC的侵襲和轉移

環(huán)狀RNA在TNBC的侵襲和轉移過程中起著重要作用[25]。上皮間充質(zhì)轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是以上皮細胞極性和黏附能力喪失,間充質(zhì)增加為特征的過程,該過程可通過增強移動性、侵襲性和對凋亡刺激的抵抗,賦予腫瘤細胞轉移特性。circKIF4A[29]和circPLK1[30]等環(huán)狀RNA通過不同的分子機制最終靶向EMT信號通路,從而促進TNBC細胞的侵襲和轉移。circNR3C2在TNBC中顯著下調(diào),其表達與TNBC的遠處轉移及預后呈負相關。體內(nèi)外實驗進一步表明,circNR3C2/miR-513a-3p/HRD1軸通過誘導多泛素介導的波形蛋白降解,抑制TNBC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT過程[31]。曾凱旋[32]發(fā)現(xiàn),circANKS1B通過誘導EMT促進TNBC細胞系MDA-MB-231在體內(nèi)外的侵襲和轉移能力,而對腫瘤的增殖和生長無影響。在機制上,circANKS1B通過競爭性吸附miR-148a-3p和miR-152-3p,增加了轉錄因子USF1的表達,激活轉化生長因子-β1/Smad信號通路,最終促進EMT。劉慶等[33]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA circ0000799可經(jīng)miR-1287-5p/GPX4軸調(diào)控鐵死亡促進三陰乳腺癌腦轉移。

3.3 調(diào)控TNBC的耐藥

化療是TNBC患者的關鍵治療方案。TNBC常用的化療藥物包括環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素(adriamycin,ADM)和紫杉醇(paclitaxel,PTX)等。早期TNBC的標準治療方案為新輔助化療后手術。對于復發(fā)或難治性TNBC患者,目前還沒有標準的化療方案。晚期TNBC患者可用的治療方法包括抗代謝物卡培他濱和吉西他濱、非紫杉烷微管動力學抑制劑艾瑞布林和DNA交聯(lián)鉑類藥物[34]。而化療耐藥是目前臨床治療的主要限制因素。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA在TNBC化療耐藥過程中發(fā)揮重要作用。circKDM4C[35]被發(fā)現(xiàn)在TNBC中與ADM耐藥相關。circGFRA1[36]被報道可能是導致TNBC細胞對PTX耐藥的重要因素。circHER2編碼一種新型蛋白質(zhì)HER2-103,因為HER2-103與HER2 CR1結構域具有大部分相同的氨基酸序列,所以HER2-103可被HER2抗體帕妥珠單抗拮抗。帕妥珠單抗能顯著降低circ-HER2/HER2-103陽性TNBC細胞的體內(nèi)致瘤性,但對不表達circ-HER2/HER2-103的TNBC細胞無影響[37]。

4 環(huán)狀RNA在TNBC的臨床意義

4.1 TNBC的診斷和預后標志物

早期篩查和診斷可提高TNBC的療效,降低TNBC患者的死亡率。環(huán)狀RNA存在以下特征:①因其末端的閉環(huán)結構,環(huán)狀RNA比線性RNA更為穩(wěn)定;②在組織中廣泛表達,部分環(huán)狀RNA的表達水平比其親本基因的mRNA更高;③存在組織以及階段的特異性,部分環(huán)狀RNA的組織特異性比其親本基因的mRNA更高。由于環(huán)狀RNA在構象、穩(wěn)定性、豐度、時空特異性表達和免疫原性上都不同于mRNA,與其他標志物相比,環(huán)狀RNA作為生物標志物可能具有更好的分析有效性[38]。研究報道,TNBC患者的乳腺組織標本和體液中可檢測到不同的特異性環(huán)狀RNA,這些環(huán)狀RNA有可能作為理想的TNBC診斷標志物,在TNBC活檢方面有極大的應用前景[39]。此外,與生存期和臨床病理特征相關的環(huán)狀RNA可能是TNBC患者的獨立預后因素。研究證實,環(huán)狀RNA的表達與TNBC的臨床參數(shù)顯著相關,包括腫瘤大小、淋巴結轉移、組織學分級、TNM分期、總生存期和無病生存期等,已有報道21種環(huán)狀RNA對TNBC患者具有預后價值[25]。馮晴等[40]發(fā)現(xiàn),血清miR-21、miR-30b對乳腺癌患者術后曲妥珠單抗靶向治療心臟毒性具有很好的預測價值。本團隊發(fā)現(xiàn),circKIF4A與腫瘤分級、淋巴結及遠處轉移相關,是TNBC的獨立預后因素,而circFBXW7的表達與腫瘤分期、淋巴結轉移呈負相關[29]。

4.2 TNBC的潛在治療靶點

環(huán)狀RNA通過扮演促癌因子或抑癌因子的角色,參與了TNBC細胞的增殖、轉移、凋亡,以及TNBC血管生成和耐藥等過程[25]。因此,環(huán)狀RNA可作為TNBC的潛在治療靶點。針對促癌的環(huán)狀RNA反向剪接位點設計小干擾RNA和互補的反義寡核苷酸,使用CRISPR-Cas9編輯來誘導促癌環(huán)狀RNA失活,或者通過遞送含有重復miRNA結合位點的環(huán)狀RNA增加抑癌環(huán)狀RNA的含量,將可能產(chǎn)生顯著的抑癌作用。He等[41]證明,尾靜脈注射靶向ciRS-7的小干擾RNA可以抑制TNBC細胞在體內(nèi)肝和肺轉移,這表明促癌的ciRS-7有可能成為TNBC治療的潛在治療靶點;隨著技術的發(fā)展,細胞外囊泡和納米粒子可用于增強環(huán)狀RNA在體內(nèi)的導入或傳遞過程。對于編碼蛋白的環(huán)狀RNA,可以在其開放閱讀框前加入IRES元件,極大地提高編碼蛋白的表達水平,具有產(chǎn)生腫瘤抑制蛋白、腫瘤特異性抗體或免疫刺激細胞因子等潛力[42]。干擾耐藥相關環(huán)狀RNA也可能影響TNBC患者對化療的敏感性。circGFRA1通過TLR4通路促進TNBC對PTX的耐藥。在PTX處理的TNBC PDX小鼠模型中,與對照組小鼠相比,敲低circGFRA1組小鼠的TLR4表達量降低,腫瘤的體積也縮小[36]。

5 結語與展望

環(huán)狀RNA參與TNBC的發(fā)生發(fā)展及耐藥過程。但由于環(huán)狀RNA的研究進展大多發(fā)生在近十年間,其作用機制和功能尚存在疑點和爭議,合成技術和研究方法存在局限性,與腫瘤驅(qū)動基因之間的關系仍未明確。此外,有學者提出,那些低豐度的環(huán)狀RNA很可能是剪接過程的副產(chǎn)物,且?guī)缀鯖]有功能[43];但這些低豐度環(huán)狀RNA存在序列同源折疊,這給目前的環(huán)狀RNA的檢測和定量方法帶來了挑戰(zhàn)。盡管天然環(huán)狀RNA的作用和合成的環(huán)狀RNA生物學功能仍有待進一步探索,但目前環(huán)狀RNA作為一類新興的腫瘤生物標記物、RNA治療藥物和疫苗已展示出廣泛的應用前景。隨著技術的發(fā)展及臨床試驗的進行,基于環(huán)狀RNA的應用將得以開展,為TNBC患者帶來可靠的生物標記物和新的治療靶點。