張文杰 吳澤鈺 夏雨凝 趙 今

糖尿病是全球增長最快的疾病之一，預(yù)計到2045 年將影響6.93 億成年人，目前已成為全球廣泛關(guān)注的慢性代謝疾病之一[1]。牙周?。╬eriodontal diseases，PD）是由多種復(fù)雜因素(遺傳、環(huán)境和細(xì)菌感染等)共同作用導(dǎo)致的感染性疾病，能夠造成牙周組織的破壞，最終導(dǎo)致牙齒脫落[2]。流行病學(xué)研究證實(shí)牙周炎是糖尿病的第六大并發(fā)癥，且糖尿病患者患牙周炎的風(fēng)險是非糖尿病患者的三倍[3]糖尿病患者伴發(fā)牙周炎在國際上已經(jīng)被公認(rèn)為是一種特殊類型的牙周疾病,稱為糖尿病牙周炎[4]，目前臨床上常采用全身給藥的方式治療糖尿病，其不僅毒副作用較強(qiáng)，且無法同時改善罹患牙周炎患者的牙周狀況。近年來，中醫(yī)藥用于輔助治療牙周炎獲得了很好的療效，并且很多中藥在抗炎的同時還具有降血糖的作用，國內(nèi)外已有較多學(xué)者將傳統(tǒng)中藥用于DP進(jìn)行了相關(guān)研究。研究證實(shí)，桑葉富含多種活性成分，如多糖、黃酮類和維生素等，具有抗炎、降糖和促進(jìn)骨組織形成的潛在作用[5]。然而，對于桑葉水提物在高糖環(huán)境下對成骨分化的影響，目前的了解還十分有限。因此，本研究旨在評估桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化的影響，可以進(jìn)一步為桑葉水提物用于治療DP 提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料

（1）細(xì)胞株小鼠成骨前體細(xì)胞株（MC3T3-E1）（貨號：CL-0387），購自武漢普諾賽生物生命科技有限公司。

（2）藥物桑葉水提物粉末，購自中國上海源葉，貨號：S28490 純度：≥98%。

（3）主要試劑α-MEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；0.25%胰蛋白酶、地塞米松、胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗（BI，印度）；細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒CCK-8（Dojindo，日本）；成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色試劑盒（貨號：C0148）、BCIP/NBT 堿性磷酸酶染色試劑盒(貨號：C3206)、堿性磷酸酶檢測試劑盒（貨號：P0321）購于碧云天生物科技有限公司（中國）；4%多聚甲醛（Biosharp 生物，中國）；Trizol（invitrogen，美國）；,酶聯(lián)免疫吸附ELISA 試劑盒（睿信生物，中國），碧云天凋亡試劑盒（貨號：c1062L），碧云天ROS 檢測試劑盒（貨號：S033M）；TB Green Premix ExTaqTMII、PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購買于Takara 生物技術(shù)有限公司（Takara Biomedical Technology Co,Ltd，日本）。

（4）主要實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺（蘇凈安泰，中國）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、熒光倒置顯微鏡（Leica，德國）、全波長酶標(biāo)儀（Thermo，美國）、實(shí)時熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 7500 Fast，美國）。

2.方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：將課題組凍存的MC3T3-E1 細(xì)胞放入37℃恒溫水浴箱復(fù)蘇，加入含血清的培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度大于80%時，可按1:3 的比例傳代培養(yǎng)，隔天換液，將其傳代培養(yǎng)至P4 時開始用于后續(xù)各實(shí)驗(yàn)。

（2）藥物的配置：①不同濃度高糖培養(yǎng)基的配置：稱取4.504 g 葡萄糖，充分溶解于50 mL 的α-MEM 完全培養(yǎng)基中，于超凈臺中用0.22 nm 的濾器過濾，得到500 mM 的母液，將其分裝于15 mL 離心管中置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)過程中將其稀釋為：10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、100 mM 的工作液。②不同濃度桑葉水提物的配置：將10 mg 桑葉提取物粉末溶于1 mL 的含50 mM葡萄糖的α-MEM 培養(yǎng)基中充分混勻，在超凈臺中用0.22 nm 的濾器過濾，得到10 mg/mL 的桑葉水提物母液，將其分裝于1.5 mL 的無菌EP 管中，-20℃冰箱儲存。實(shí)驗(yàn)過程中將藥物分別稀釋為：10 mg/mL、1 mg/mL、100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL的工作液。

（3）CCK-8 檢測高糖濃度及桑葉水提物濃度對MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖影響：①CCK-8 篩選適宜高糖濃度：將長至80%～90%的P4 代MC3T3-E1 細(xì)胞用胰酶消化后將細(xì)胞調(diào)整為2×104個/mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，分別加入含5 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、100 mM 葡萄糖的完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d、3 d、5d、7 d 后棄原培養(yǎng)基，加入100 μLα-MEM 培養(yǎng)基及10 μL CCK8 溶液，放入37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育2 h 。用酶標(biāo)儀在450 nm波長時測定吸光度。②篩選出適宜藥物濃度：步驟同上，不同之處在于細(xì)胞貼壁后分別加入含10 mg/mL、1 mg/mL、100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL桑葉水提取物的培養(yǎng)基。

（4）實(shí)驗(yàn)分組：不含葡萄糖的對照組（control組）；含50 mM 葡萄糖的高糖組（HG 組）；50 mM 葡萄糖+含不同濃度桑葉水提取物（1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL）的實(shí)驗(yàn)組（HSY組）。

（5）細(xì)胞凋亡：取對數(shù)期生長的MC3T3-E1 細(xì)胞以4.0×105個細(xì)胞/皿的密度接種到6 cm 培養(yǎng)皿中，每孔4 mL，貼壁后按分組干預(yù)72 h，按說明書操作，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光，室溫孵育10 min；再加入5 μL PI 染料，混勻避光，室溫孵育5 min。補(bǔ)加200 μL的1×Binding Buffer，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

（6）MC3T3-E1 的ROS 檢測：按上述方法進(jìn)行鋪板及干預(yù)，于72 h 后將ROS 熒光探針按1:1000 的比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，避光保存。取出培養(yǎng)皿，胰酶消化后轉(zhuǎn)移至離心管中離心（1000 rpm，5 min）。棄原培養(yǎng)基加入無酚紅的α-MEM 培養(yǎng)基重懸后繼續(xù)離心。棄培養(yǎng)基后加入1 mL ROS 熒光探針溶液，放置于37℃恒溫箱中避光孵育30 min，棄液，使用不含酚紅的α-MEM 重復(fù)上述清洗步驟3遍，過篩后轉(zhuǎn)移至流式管中，短時間內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

（7）不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響：將細(xì)胞接種于12 孔板，待細(xì)胞貼壁后按分組加入藥物進(jìn)行干預(yù)72 h，取1 mL 培養(yǎng)液離心（4000 rpm，20 min），取上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，-20℃保存。按相關(guān)說明書操作。

（8）堿性磷酸酶染色：細(xì)胞傳代培養(yǎng)至P4 代后調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個/孔的密度接種于12 孔板，待細(xì)胞長至80%左右，更換為含不同濃度的桑葉水提取物的高糖培養(yǎng)基,2 天/次進(jìn)行換液，誘導(dǎo)7 d、14 d 后棄原培養(yǎng)基加入PBS 清洗3 遍，加入1 mL 組織細(xì)胞固定液固定30 min，棄液后，PBS清洗3次，加入800 μL 現(xiàn)配的堿性磷酸酶孵育液放入37℃烘箱中避光孵育15 min，棄液后PBS 清洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

（9）堿性磷酸酶活性：步驟同上，棄液后加入預(yù)冷的PBS 清洗，每孔加入60 μL 無抑制劑細(xì)胞裂解液，裂解至1.5 mL 的無菌EP 管中，5 min/次渦旋，12000 r/min，4℃條件下離心15 min，取上清于新的EP 管中作為待測樣本保存于-80℃?zhèn)溆?。BCA 法測得待測樣本蛋白濃度；按照堿性磷酸酶試劑盒說明書于96 孔板中操作：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測孔，依次加入標(biāo)準(zhǔn)液、緩沖液、基質(zhì)液，充分混勻，37 ℃水浴15 min 后加入顯色劑終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在520 nm 波長處測定各孔吸光度OD 值。計算金氏單位（U/mg）用以反映ALP 活性。細(xì)胞中ALP活力=測OD 值-空白OD 值/標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.1 mg/mL）÷待測樣本蛋白濃度。

（10）茜素紅染色：將P4 代細(xì)胞以3×104個/孔的密度接種于3.5 cm的小皿中，待細(xì)胞長至80%左右，棄原培養(yǎng)基，加入含不同濃度的桑葉水提物的高糖成骨培養(yǎng)基，隔天換液，分別于14 d、21 d 時終止培養(yǎng)。PBS 清洗小皿，組織細(xì)胞固定液室溫下固定30 min后棄固定液，純水清洗小皿，棄液后加1 mL茜素紅染液室溫下染色30 min，棄染液用純水清洗小皿，清亮為止。顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)并拍照記錄。

（11）茜素紅定量：配置氯化十六烷基吡啶溶液（每克加入10 mL 水至其完全溶解），上述小皿拍照完成后棄純水，每皿加入1 mL 氯化十六烷基吡啶溶液放置于水平搖床溶解30 min，吹打混勻，將其轉(zhuǎn)移至96 孔板中每孔100 μL，于562 nm 的波長下檢測其OD值。

（12）RT-PCR 檢測基因表達(dá)：將傳代培養(yǎng)至P4代的細(xì)胞在含藥的成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3 d、7 d，每組設(shè)3 個平行孔。利用Trizol 法提取總RNA，定量后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR 反應(yīng)條件：①預(yù)變性95 ℃2 min；②變性95 ℃5 s；③退火58 ℃30 s，共40個循環(huán)；④延伸72 ℃，5 min。檢測相關(guān)mRNA 的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。

3.統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS26.0 及Graphpad 統(tǒng)計軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢測，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性，則采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采取Dunnett-t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05，α=0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.CCK-8篩選出高糖濃度及桑葉水提物濃度

如圖1 所示，低濃度葡萄糖對細(xì)胞的增殖影響不大，甚至還能促進(jìn)細(xì)胞的增殖；但隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)胞的增殖開始下降。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)葡萄糖濃度在0～30 mM 時，短時間內(nèi)其細(xì)胞增殖甚至大于control 組（P＜0.05）,當(dāng)糖濃度在50～100 mM 時細(xì)胞增殖能力受到抑制（P＜0.05），結(jié)果與歐等[6]結(jié)果一致，故選用50 mM的葡萄糖濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度的葡萄糖對MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響

如圖2 所示，將含有50 mM 葡萄糖的α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3 細(xì)胞，并加入不同濃度的桑葉水提物分別干預(yù)1 d、3 d、5 d、7 d。隨著干預(yù)時間的延長，細(xì)胞的OD值與對照組相比在10 mg/mL～1 μg/mL范圍內(nèi)不斷升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)桑葉水提物在1～100 μg/mL 時，與對照組相比其細(xì)胞增殖活性促進(jìn)更明顯且穩(wěn)定，故選用1～100 μg/mL作為有效藥物濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響

2.桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1 細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)顯示桑葉水提物在高糖刺激下的MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡具有影響（圖3）。第一象限是由晚期凋亡細(xì)胞組成。第二象限是指PI 陰性的細(xì)胞，第三象限是指未被染色的正常活細(xì)胞。第四象限是指早期凋亡細(xì)胞。對照組和高糖組的早期凋亡率分別為(15.00±0.94)%和(30.90 ±0.19)%。桑葉水提物組分別為(14.15±1.96)%、(16.65±1.53)%和(19.35±1.96)%.高糖組于對照組相比顯著促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），在高糖環(huán)境下加入桑葉水提取物后均可在一定程度上降低細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05），尤其是高濃度的桑葉水提取物。可以得出結(jié)論，桑葉水提取物可顯著保護(hù)細(xì)胞免受高糖刺激引起的凋亡。

圖3 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響

3.不同濃度的桑葉水提物對高糖環(huán)境下的MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)

如圖4 所示，對照組和高糖組的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平分別為(50.75±0.02)%和(81.55±0.78)%.桑葉水提物分別為(20.15±5.07)%、(33.9±10.65)%和(40.15±11.24)%。流式結(jié)果表明與正常組相比在高糖狀態(tài)下的MC3T3-E1 細(xì)胞會產(chǎn)生更多的ROS（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組與高糖組相比，均可以在一定程度上緩解因高糖刺激引起的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高，尤其是100 μg/mL 的桑葉水提物濃度。且其ROS水平較正常組更低，完全逆轉(zhuǎn)了因高糖刺激引起的氧化應(yīng)激損傷。

圖4 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)

4.不同濃度的桑葉水提物對高糖環(huán)境下的MC3T3-E1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

通過ELISA 檢測上清液中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平（見圖5），與對照組（control）相比，高糖組（HG）上清液中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）、白細(xì)胞介素-1（interleukin 1，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）的表達(dá)量明顯升高。加入不同濃度的桑葉水提物干預(yù)后，與HG組相比，均能在一定程度上抑制相關(guān)因子的表達(dá)（P＜0.05），尤其是高濃度的桑葉水提物（P＜0.01）。

圖5 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)

5.桑葉水提物對MC3T3-E1 細(xì)胞ALP 活性的影響

ALP 是成骨分化的早期標(biāo)志物之一，與對照組相比如圖6 所示，桑葉水提物的ALP 活性在用藥物干預(yù)培養(yǎng)7 d、14 d 后，高糖組ALP 活性與對照組相比顯著降低。與高糖組相比1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL 桑葉水提取物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組ALP 表達(dá)能力隨著劑量的升高逐漸升高（P＜0.05），藥物組均可以緩解高糖刺激引起的ALP 活性降低，且存在以劑量依賴的方式增加ALP活性的表達(dá)能力。

6.桑葉水提物對MC3T3-E1 細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響

成骨細(xì)胞在細(xì)胞增殖分化過程中會產(chǎn)生細(xì)胞外鈣化物沉積，將MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d、21 d，如圖7 所示，在與14 d、21 d 茜素紅染色的結(jié)果圖中均可看出與對照組相比HG 組的鈣化能力顯著下降，藥物組可有效促進(jìn)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的分化且存在劑量依賴。尤其在100 μg/mL 時可以逆轉(zhuǎn)高糖對成骨細(xì)胞分化的影響。

圖7 不同濃度的桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞A細(xì)胞礦化能力的表達(dá)

7.桑葉水提物對成骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子（apoptosis regulator Bcl-2，Bcl-2）、凋亡調(diào)節(jié)因子Bax(apoptosis regulator Bax,Bax)mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，HG 組Bax 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且Bcl-2 表達(dá)明顯增多（P＜0.05）。加入桑葉水提取物后，與HG 組相比，隨著桑葉水提物濃度增高，Bax 的表達(dá)呈遞減趨勢，且Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，3 d與7 d的結(jié)果基本一致（圖8）。

圖8 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

8.桑葉水提物對成骨細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNFαmRNA表達(dá)的影響

與ELISA 結(jié)果基本一致，與對照組相比，HG 組炎癥相關(guān)的mRNA表達(dá)明顯降低。加入桑葉水提取物后，與HG 組相比，隨著桑葉水提物濃度增高，mRNA的表達(dá)呈遞減趨勢（圖9）。

圖9 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)基因

9.桑葉水提物對成骨細(xì)胞成骨相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響

在高糖環(huán)境下MC3T3-E1 細(xì)胞的runt 相關(guān)基因2（runt-related transcription factor2, Runx2）、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix,OSX)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Type,Col-1)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor，IGF-1）的mRNA 的表達(dá)顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與高糖組相比，藥物干預(yù)后的細(xì)胞中mRNA 的表達(dá)呈劑量依賴性增加（圖10、11）。

圖10 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)（3天）

圖11 不同濃度桑葉水提物在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)（7天）

討論

長期的高血糖是導(dǎo)致患骨類疾病風(fēng)險顯著增加的主要原因之一[6]。因此，本研究通過CCK8 法檢測MC3T3-E1 在高糖環(huán)境下第1、3、5、7 天的增殖情況，與劉等[7]的研究結(jié)果相似，從第3 天開始，50 mM的高糖環(huán)境均能夠顯著抑制MC3TC-E1的增殖。造成這個現(xiàn)象的原因可能是由于短時間內(nèi)升高低濃度的葡萄糖為細(xì)胞提供了更加充足的養(yǎng)分反而促進(jìn)了其增殖，而較高的糖濃度短時間內(nèi)就對細(xì)胞產(chǎn)生了損傷。故本實(shí)驗(yàn)采用50 mM的葡萄糖模擬體內(nèi)高糖環(huán)境。

通過對天然藥物的研究發(fā)現(xiàn)，天然藥物可緩解因高糖刺激引起的成骨細(xì)胞分化能力減弱和氧化應(yīng)激。而桑葉作為我國傳統(tǒng)中藥材，含有酚類、生物堿類、多糖類、氨基酸類等多種活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎和抗腫瘤等藥理作用[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桑葉水提物可以在正常及炎癥環(huán)境中促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。然而，目前關(guān)于桑葉水提物對高糖環(huán)境下前成骨細(xì)胞增殖和分化的研究較少。本研究通過CCK-8 法檢測高糖環(huán)境下MC3T3-E1 加入桑葉水提物后的增殖情況，最終選取了1～100 μg/mL 的桑葉水提物用于接下來的實(shí)驗(yàn)，并觀察桑葉水提物在高糖環(huán)境下對前成骨細(xì)胞成骨分化的作用研究。

成骨細(xì)胞的增殖是骨形成的重要階段之一。目前關(guān)于桑葉水提物對高糖環(huán)境下前成骨細(xì)胞凋亡的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖刺激可以引起前成骨細(xì)胞的凋亡率增加，加入桑葉水提物在一定濃度范圍內(nèi)能緩解因高糖刺激而引起的細(xì)胞凋亡。100 μg/mL 的桑葉水提物在抑制因高糖刺激引起的凋亡最為明顯。Bax 是一種促凋亡蛋白基因，Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白基因，在成骨細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下加入一定濃度的桑葉水提物后抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)增高，凋亡蛋白Bax 表達(dá)降低，Bcl-2/Bax 比值升高，且與桑葉水提物的濃度有一定的關(guān)系。因此，推測桑葉水提物在一定濃度范圍內(nèi)可能通過調(diào)控Bax/Bcl-2來抑制前成骨細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是由高血糖狀態(tài)下介導(dǎo)胰島β 細(xì)胞損害的重要病因，被認(rèn)為是糖尿病合并骨質(zhì)疏松、牙周病、冠心病、動脈粥樣硬化等的共同發(fā)病機(jī)制[10,11]。氧化應(yīng)激會造成ROS 大量產(chǎn)生，當(dāng)體內(nèi)ROS 超出了機(jī)體清除率時會導(dǎo)致細(xì)胞的有氧損傷，從而加劇體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7,11]，清除ROS能夠有效促進(jìn)細(xì)胞的成骨能力，高糖狀態(tài)產(chǎn)生過量ROS 會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平下降，將抑制細(xì)胞的成骨分化[12,13]。糖尿病及牙周炎均會造成氧化應(yīng)激升高，當(dāng)牙周處于炎癥狀態(tài)時,機(jī)體內(nèi)抗氧化水平的降低會進(jìn)一步加劇糖尿病狀態(tài)下的氧化失衡狀態(tài)[14]。糖尿病伴隨牙周炎會加重局部和全身的氧化損傷，氧化應(yīng)激的增加又會損害牙周組織[15]。而且ROS的過度產(chǎn)生與糖尿病的AGEs 密切相關(guān)，AGES 大量產(chǎn)生會導(dǎo)致IL-1β、TNF-α 和IL-6 等炎癥介質(zhì)的分泌增多，會導(dǎo)致牙槽骨的快速喪失，繼而影響相關(guān)成骨指標(biāo)的表達(dá)[16]。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為可能是糖尿病牙周炎致病中的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比高糖環(huán)境明顯促進(jìn)了ROS 的產(chǎn)生和相關(guān)炎性因子的表達(dá)。加入桑葉水提物后，可在一定程度上能抑制ROS 的產(chǎn)生和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，表明桑葉水提物能夠緩解因高糖刺激引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

高糖環(huán)境會產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)而導(dǎo)致牙槽骨的吸收和破壞，而牙槽骨主要通過成骨和破骨細(xì)胞的共同作用改建，包括骨生成和骨吸收[18]。因此本研究檢測了與骨形成和礦化相關(guān)成骨指標(biāo)的表達(dá)情況。IGF-1 是細(xì)胞及組織代謝過程中的中間產(chǎn)物，參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)[19,20]，當(dāng)其作用于成骨細(xì)胞，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖、分化以及促進(jìn)成骨礦化相關(guān)基因的表達(dá)[21,22]。ALP、Runx2、OCN、COL-1、Osterix 作為骨細(xì)胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，對骨的分化及改建方面有著至關(guān)重要的作用[23～25]。本研究通過堿性磷酸酶染色及活性以及檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況來探究高糖狀態(tài)下成骨細(xì)胞的成骨分化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，高糖組堿性磷酸酶活性及成骨相關(guān)mRNA 表達(dá)情況明顯降低，說明高糖環(huán)境可以抑制成骨細(xì)胞的分化能力，加入桑葉水提物后可能通過抵抗ROS 的產(chǎn)生從而逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下成骨基因表達(dá)低的情況。

綜上，桑葉水提物能夠?qū)Ω咛黔h(huán)境下MC3T3-E1 細(xì)胞發(fā)揮良好的抗炎及抗氧化能力，緩解甚至逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境引發(fā)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞氧化應(yīng)激進(jìn)而促進(jìn)高糖環(huán)境中細(xì)胞的增殖活性、成骨分化功能及基質(zhì)礦化能力。該研究雖然闡述了桑葉水提物對高糖狀態(tài)下成骨細(xì)胞分化的影響，但體外高糖環(huán)境并不能完全模擬糖尿病在體內(nèi)對骨損傷的致病機(jī)理，后期還需進(jìn)一步完善相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，為桑葉水提物用于糖尿病牙周炎的防治提供更多的參考依據(jù)。