褚鳳冉，劉路政，武金才，3

（1.海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院介入血管外科，海南 ?？?570216；3.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院（海南省人民醫(yī)院）肝膽胰外科，海南 ?？?570311）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)以及全球范圍內(nèi)較常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］，臨床發(fā)現(xiàn)多屬中晚期，預(yù)后較差，最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，發(fā)展到晚期也常出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移的情況，多見(jiàn)于肺、骨、腹腔、腦等［2］。手術(shù)切除仍是目前肝癌獲得長(zhǎng)期生存的主要治療手段［3-5］。術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是肝癌病人死亡的主要原因，其相關(guān)潛在機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。因此，探討肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，對(duì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移早期監(jiān)測(cè)與發(fā)現(xiàn)和靶向治療的選擇等具有重要的臨床意義。

CircRNA 廣泛存在于人體外周血、外泌體甚至無(wú)細(xì)胞唾液等，它是具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA；不具有5'端特殊的帽子（cap）結(jié)構(gòu)和3'末端poly（A）尾；是由pre-mRNA 上下游外顯子的剪接受體位點(diǎn)和供體位點(diǎn)通過(guò)反向剪接或驅(qū)動(dòng)循環(huán)等相互作用的方式產(chǎn)生［6，7］。在剪接過(guò)程中，同一基因可以通過(guò)選擇性環(huán)狀化產(chǎn)生不同的circRNA，造成circRNA的多樣性。不同物種間的同源性研究表明，circRNA 在物種進(jìn)化中具有高度保守的特性和組織特異性。CircRNA 在小鼠和人之間同源性達(dá)到20%或以上，而小鼠和人的表達(dá)譜卻又大相徑庭，并且隨著不同物種之間腦部的發(fā)育，表達(dá)逐漸上調(diào)［8，9］。除以上特點(diǎn)外，circRNA 還具有很多功能，比如circRNA 可 扮 演microRNA 或RNA 結(jié) 合 蛋 白 的“海綿”角色，參與調(diào)節(jié)分子間信號(hào)交流，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制下游基因的表達(dá)等［10］。

m6A 自20 世紀(jì)70 年代發(fā)現(xiàn)以來(lái)就被認(rèn)為是大多數(shù)真核生物中最普遍的內(nèi)部修飾之一，平均每個(gè)mRNA 就有3～5 個(gè)m6A 的修飾［11］。m6A 修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程，十分類似于DNA 甲基化，受修飾 酶 復(fù) 合 物“writers”（METTL3、METTL14、WTAP 等）和脫修飾酶“erasers”（ALKBH5、FTO等）控制，經(jīng)識(shí)別蛋白“readers”讀取m6A 位點(diǎn)，發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)［12］。m6A 修飾在轉(zhuǎn)錄組中的沉積有規(guī)律可循，多在CDS 和3'UTR 中富集，并在終止密碼子區(qū)附近的富集程度更高［13］。研究表明，m6A 修飾基因表達(dá)調(diào)控與生物體的正常生理活動(dòng)密切相關(guān)，無(wú)論是修飾mRNA、核糖體RNA（rRNAs）、以及circRNA 等，都在病理生理過(guò)程中動(dòng)態(tài)調(diào)控，包括腫瘤發(fā)生與侵襲轉(zhuǎn)移［14］。但目前研究表明其深入作用機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。

1 m6A 修飾在circRNA 中調(diào)控作用

1.1 m6A 驅(qū) 動(dòng)circRNA 翻 譯

CircRNA 通?？梢砸灶愃朴贗RES 的方式驅(qū)動(dòng)circRNA 的翻譯［15］。近來(lái)研究表明，circRNA 也可以經(jīng)m6A 修飾途徑翻譯，此過(guò)程經(jīng)識(shí)別蛋白“readers”讀取m6A 位點(diǎn)并與YTH 結(jié)構(gòu)域家族蛋白3（YTHDF3）相互作用，招募EIF4G2 啟動(dòng)翻譯，此過(guò)程經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14 增強(qiáng)，也可以被脫甲基化酶FTO 和生精細(xì)胞 ALKBH5 （alkB homolog 5）抑制［16］。此外，Li 等［17］研究發(fā)現(xiàn)3'UTR 中的m6A可通過(guò)與YTHDF1 結(jié)合以提高翻譯效率，5'UTR中的m6A 可促進(jìn)不依賴于帽子結(jié)構(gòu)的翻譯。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序的快速發(fā)展，多體分析、計(jì)算預(yù)測(cè)和MeRIP-seq 和RNA-seq 聯(lián)合分析等進(jìn)一步表明m6A 驅(qū)動(dòng)的circRNA 翻譯廣泛存在，但m6A 影響蛋白質(zhì)翻譯的機(jī)制仍不明確。

1.2 m6A 調(diào) 節(jié)circRNA 的 降 解

因circRNA 不具有5'末端帽子和3'末端 poly（A）尾巴，且具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此不易被外切酶降解。有研究報(bào)道，具有完美互補(bǔ)miRNA 靶點(diǎn)的circRNA 可通過(guò)Ago2 蛋白介導(dǎo)的方式而降解，但對(duì)那些沒(méi)有miRNA 海綿功能或特異性microRNA 靶點(diǎn)的circRNA 不起作用［16］。然而Park 等［18］研究表明，m6A 識(shí)別YTHDF2 并結(jié)合靶分子，募集HRSP1，介導(dǎo)RNA 核酸內(nèi)切酶RNase P/MRP 復(fù)合物切割靶分子，這一過(guò)程作用于mRNA 也可作用于circRNA；其中HRSP12 介導(dǎo)YTHDF2 和RNase P/MRP 的連接，促進(jìn)YTHDF2 結(jié)合靶分子快速降解。CircRNA 的降解由m6A 修飾介導(dǎo)的多重基因調(diào)控，其具體機(jī)制仍需探討。

1.3 m6A 修飾增強(qiáng)circRNA 的穩(wěn)定性、

m6A 的“writers”METTL3 和METTL14 中 存在一個(gè)s-腺苷蛋氨酸結(jié)合基序，以1∶1 的比例形成異源二聚體復(fù)合物，提高穩(wěn)定性，METTL14 在穩(wěn)定METTL3 和識(shí)別靶RNA 方面發(fā)揮著重要作用［16］。WTAP 作為m6A 甲基化復(fù)合體的主要調(diào)控分子和組成分子，可以幫助METTL3 和METTL14 定位，增強(qiáng)RNA 的穩(wěn)定性，隨后的研究表明m6A 修飾也調(diào)控circRNA 的穩(wěn)定性從而影響腫瘤進(jìn)展［16］。m6A 的“erasers”ALKBH5 和YTHDF2 也 可 影 響RNA 穩(wěn)定性［19］，最新研究表明，CircCPSF6作為一致癌基因，其在體內(nèi)外可增強(qiáng)HCC 細(xì)胞增殖和侵襲能力。CircCPSF6 表達(dá)與ALKBH5 呈正相關(guān)，與YTHDF2 呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)MeRIP 檢測(cè)及構(gòu)建重組的熒光素酶報(bào)告研究（插入具有野生型或突變型m6A 位 點(diǎn)）發(fā) 現(xiàn)ALKBH5 調(diào) 節(jié)circCPSF6 的m6A修飾，進(jìn)而改變靶基因circCPSF6的穩(wěn)定性并調(diào)節(jié)其表達(dá)。且circCPSF6 的降解也與m6A 修飾有關(guān)，并 經(jīng)YTHDF2 調(diào) 節(jié)［20］。而 目 前circCPSF6 的 合 成（后剪接過(guò)程）是由m6A 修飾還是其他因子調(diào)控仍是個(gè)謎。

1.4 m6A 修飾改變下游基因的狀態(tài)

m6A 還可以通過(guò)改變下游分子的甲基化狀態(tài)以影響circRNA 功能。YAP 作為主要應(yīng)答因子之一存在于Hippo 通路下游，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。2018 年Zhang 等發(fā)現(xiàn)circ_104075 在HCC中上調(diào)表達(dá)機(jī)制，并刺激HCC 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的下游機(jī)制；研究發(fā)現(xiàn)circ_104075 可以通過(guò)YAP 結(jié)合miR-582-3p 促進(jìn)腫瘤發(fā)生，YAP 中存在于3'UTR的m6A 修飾通過(guò)促進(jìn)circ_104075 與miR-382-5p 相互作用使YAP 功能抑制［21］。

1.5 m6A 修飾的circRNA 在先天免疫中的作用

CircRNA 具有封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易引起先天免疫。然而最近的研究表明，一些外源性circRNA入侵會(huì)促進(jìn)先天免疫發(fā)揮作用，并在病毒感染時(shí)提供保護(hù)［22］。未經(jīng)m6A 修飾的外源性circRNA（circ-FOREIGN）可在K3 連接的多聚泛素分子存在時(shí)激活免疫系統(tǒng)［23］。內(nèi)源性circRNA 易形成16～26 bp的RNA 雙鏈，抵抗先天免疫中的雙鏈RNA（dsRNA）激活的蛋白激酶［24］。由ZKSCAN1 內(nèi)含子生成的circSELF，其作用機(jī)制與WTAP、KIAA1429（m6A“writers”）、YTHDF2 和HNRNPC（m6A“readers”）相關(guān)。CircSELF 可被YTHDF2 標(biāo)記為“自身”分子，逃避先天免疫的監(jiān)測(cè)，避免引起非必要的免疫反應(yīng)［25］。這些結(jié)果表明，circRNA 可能通過(guò)共價(jià)m6A 修飾標(biāo)記，發(fā)揮對(duì)先天免疫的識(shí)別功能。

1.6 m6A 修飾介導(dǎo)circRNA 在亞細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)

雖然目前對(duì)m6A 修飾circRNA 促進(jìn)亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的研究相對(duì)較少，但已有研究發(fā)現(xiàn)：m6A 修飾可調(diào)節(jié)circNSUN2 與YTHDC1 結(jié)合從細(xì)胞核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)形成 circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元復(fù)合物，并穩(wěn)定HMGA2，促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移［26］。也有研究表明：METTL14 促進(jìn)circFUT8 的m6A 修 飾，m6A 修 飾 促 進(jìn)circFUT8 細(xì) 胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展［27］。

2 m6A 修飾circRNA 在肝癌中的研究

m6A 修飾circRNA 廣泛參與多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移等，包括HCC。

2.1 m6A 修飾circRNA 與肝癌死亡（凋亡、鐵死亡）

在HCC 中，circMAP3K4 為上調(diào)的具有編碼潛能的circRNA。IGF2BP1 識(shí)別circMAP3K4 的m6A修飾并促進(jìn)其翻譯為circMAP3K4-455aa，進(jìn)而抑制AIF 的切割和核分布，防止HCC 在應(yīng)激下的細(xì)胞凋亡，circMAP3K4-455aa 介導(dǎo)泛素-蛋白酶體E3 連接酶MIB1 通路而降解［28］。

隨著m6A 修飾circSAV1 通過(guò)招募YTHDF1促進(jìn)IREB2 的翻譯，觸發(fā)COPD 的鐵死亡的最新報(bào)道，提及肝星狀細(xì)胞中IREB2 的過(guò)表達(dá)會(huì)提高鐵的水平，引起細(xì)胞鐵死亡［29］。鐵死亡是一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、壞死、自噬等［30］。circFGGY 在肝癌HepG2 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，外源性敲減circFGGY 促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的鐵死亡。m6A 修飾調(diào)節(jié)circFGGY 從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)中，調(diào)控FSP1（鐵死亡抑制蛋白1）的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控HepG2 細(xì)胞鐵死亡［31］。cIARS（hsa_circ_0008367）是HCC 細(xì)胞中經(jīng)索拉菲尼處理后表達(dá)最高的circRNA。針對(duì)cIARS 的小干擾RNA（si-cIARS）抑制HCC 鐵死亡，顯著抑制HCC 細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性。ALKBH5 負(fù)調(diào)控HCC 鐵死亡，下調(diào)ALKBH5，介導(dǎo)BCL-2/BECN1 復(fù)合物的解離，而si-cIARS 能夠有效的阻斷此過(guò)程。si-cIARS 對(duì)HCC 細(xì)胞鐵死亡的抑制也可以通過(guò)下調(diào)ALKBH5 而得到緩 解。其 中ALKBH5 是m6A 修 飾 的“erasers”［32］。但在此研究中并沒(méi)有m6A 修飾的具體作用的報(bào)道。

2.2 m6A 修飾circRNA 與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移

Du 等［33］研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于MDK基因的第5 號(hào)外顯子Hsa_circ_0095868（circMDK）海綿化miR-346和miR-874-3p，通過(guò)上調(diào)ATG16L1 而激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在這個(gè)過(guò)程中IGF2BP1 在體外與m6A 修飾的circMDK 結(jié)合，并增強(qiáng)circMDK 的穩(wěn)定性，促進(jìn)circMDK 在HCC 中顯著上調(diào)。CircGPR137B 通過(guò)circGPR137B/miR-4739/FTO 反饋環(huán)抑制HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。通過(guò)上調(diào)其靶基因FTO而介導(dǎo)circ-GPR137B 的m6A 去 甲 基 化，提 高circGPR137B 的穩(wěn)定性并促進(jìn)其表達(dá)。此外，circGPR137B 的表達(dá)可抑制肝癌的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移［34］。

CircHPS5 調(diào) 控HMGA2 的 表 達(dá)，促 進(jìn)EMT 和CSC 表型，促進(jìn)HCC 的遷移和增殖。在此過(guò)程中YTHDC1 影響下m6A 修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)輸出并增加HMGA2 表達(dá)［35］。近來(lái)，還有人發(fā)現(xiàn)METTL3 促進(jìn)hsa_circ_0058493 的m6A 修 飾，hsa_circ_0058493 的m6A 修飾位點(diǎn)與YTHDC1 結(jié)合，并以m6A 依賴的方式從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)中，最終促進(jìn)HCC 的進(jìn)展［36］。

CircKIAA1429 加 速HCC 的 進(jìn) 展，YTHDF3 促m6A 修飾進(jìn)而增強(qiáng)Zeb1（下游基因）的穩(wěn)定性，因此過(guò)表達(dá)circKIAA1429 促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展［37］。m6A 修 飾 增 強(qiáng)circRNA-SORE 的 穩(wěn) 定 性 影響肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥［38］。（見(jiàn)下表）

2.3 m6A 修 飾circRNA 與 肝 癌 免 疫

CircCCAR1 在體內(nèi)外加速了HCC 的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，外泌體circCCAR1 被CD8+T 細(xì)胞吸收，通過(guò)穩(wěn)定PD-1 蛋白引起CD8+T 細(xì)胞（CD8+T 細(xì)胞功能障礙是HCC 免疫逃逸的主要因素）功能障礙。CircCCAR1 作為miR-127-5p 的海綿，上調(diào)其靶標(biāo)WTAP，形 成 一 個(gè) 由 circCCAR1/miR-127-5p/WTAP 軸組成的反饋回路，其中WTAP 介導(dǎo)的m6A 修 飾 通 過(guò)IGF2BP3 增 強(qiáng)circCCAR1 的 穩(wěn) 定性［39］。見(jiàn)表1。

表1 m6A 修飾circRNA 在肝癌中的研究Tab 1 Research of m6A-modified circRNA in hepatocellular carcinoma

3 結(jié)語(yǔ)和展望

目前已有大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明m6A 修飾circRNA 在肝癌中的特殊作用，并推動(dòng)肝癌發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制的深入研究。文獻(xiàn)報(bào)道顯示在肝癌中，m6A 修飾多是通過(guò)促進(jìn)circRNA 翻譯、提高穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)降解、促進(jìn)亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的m6A 修飾的circRNA 將被發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)，這將對(duì)肝癌的分子診斷和治療帶來(lái)新希望，并促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的深入機(jī)制研究。

簡(jiǎn)化檢測(cè)特定m6A 修飾circRNA 水平，在有限的樣本中高效提取低豐度的circRNA，通過(guò)HCC 中不同豐度m6A 修飾的circRNA 的檢測(cè)診斷，以及根據(jù)m6A 修飾circRNA 的不同作用通路設(shè)計(jì)精準(zhǔn)的治療藥物是肝癌臨床的最終目標(biāo)。未來(lái)我們可能對(duì)m6A 修飾如何調(diào)節(jié)circRNA 的理解將不會(huì)局限于目前已知的有限方面；在m6A 對(duì)circRNA 的其他影響如加工或剪接效應(yīng)、以及m6A 修飾的circRNA在其他非腫瘤性疾病中的生物學(xué)功能等還需待探索。這些難題的探索僅僅依賴于目前發(fā)現(xiàn)的m6A修飾 circRNA 的數(shù)據(jù)庫(kù)；MeRIP-seq 和RNA-seq 聯(lián)合分析m6A 修飾circRNA；qRT-PCR、RIP（RNA immunoprecipitation assays）、RNA pull down 和 熒光素酶報(bào)告、基因檢測(cè)等方式探索m6A 修飾circRNA 的作用機(jī)制是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。挖掘新的數(shù)據(jù)庫(kù)，攻克技術(shù)難題，發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)便有效的檢測(cè)方法是目前面臨的主要問(wèn)題。

隨著m6A 修飾circSAV1 促進(jìn)IREB2 mRNA的翻譯，IREB2 上調(diào)引起COPD 細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡的最新報(bào)道，m6A 修飾circRNA 通過(guò)各種調(diào)控引起肝癌細(xì)胞鐵死亡的設(shè)想又被重提，或許這也是未來(lái)幾年的研究熱點(diǎn)。

目前對(duì)m6A 修飾的circRNA 調(diào)控肝癌發(fā)生、發(fā)展的了解只是冰山一角，揭示其調(diào)控機(jī)制和其生物學(xué)功能的深入研究還任重道遠(yuǎn)，但對(duì)于未來(lái)開發(fā)基于m6A 調(diào)控circRNA 作為肝癌診斷相關(guān)的分子標(biāo)記和潛在治療靶點(diǎn)具有重要臨床價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明

褚鳳冉：文獻(xiàn)查找、翻閱、記錄及寫作；劉路政：論文修改；武金才：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。