石 賀，于連升,2，齊心彤，錢志剛，闞連寶,*，杜仁鵬,2,,*

（1.黑龍江大學生命科學學院，農業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點實驗室，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080；2.河北環(huán)境工程學院，河北省農業(yè)生態(tài)安全重點實驗室，河北秦皇島 066102；3.上海交通大學，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

葡聚糖蔗糖酶（Glucansucrase）（EC.2.4.5.1）又稱葡糖基轉移酶（Glucosyltransferase，GTF），也稱為蔗糖-6-葡糖基轉移酶，是糖苷水解酶70（GH70）家族的一員[1]。葡聚糖蔗糖酶來源廣泛，相較于動植物來源的葡聚糖蔗糖酶，微生物分泌的葡聚糖蔗糖酶具有成本低，易獲得等優(yōu)點，并且能夠以蔗糖為底物合成分子量不同的葡聚糖和功能性低聚糖。乳酸菌作為公認安全的菌株，產生的葡聚糖蔗糖酶分子量在120～200 kDa 左右，是目前生產α-葡聚糖和低聚糖的主要來源菌株。葡聚糖及低聚糖作為潛在的益生元，因卓越的生理功能被廣泛應用于食品、醫(yī)療、化工等領域[2-3]。然而天然菌株葡聚糖蔗糖酶產量低、活性較弱，制約其在多種領域中的廣泛應用，因此開發(fā)新技術和新方法來提高葡聚糖蔗糖酶的產量和活性是目前研究的熱點。

根據催化產生葡聚糖的種類，葡聚糖蔗糖酶可分為右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase，DSR）、變聚糖蔗糖酶（Mutansucrases，MSR）[4]、交替糖蔗糖酶（Alternansucrose，ASR）、淀粉蔗糖酶（Amylosucrase，AS）[5]和羅伊糖蔗糖酶（Reuteransucrases，RSR）[6]。能夠產葡聚糖蔗糖酶的菌株包括：明串珠菌屬（Leuconostoc）[7]、乳桿菌屬（Lactobacillus）[8]、魏斯氏菌屬（Weissella）[9]、鏈球菌屬（Strptococcus）[10]、奈瑟氏菌屬（Neisseria）[11]和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）[12]等，其中Leuconostoc是目前葡聚糖蔗糖酶的主要產生菌[13-15]。Leuconostoc為革蘭氏陽性菌，菌落較小，有些菌株可形成莢膜，通常最佳生長溫度為25 ℃，是一種廣泛應用在乳制品中的乳酸菌。腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroide）作為Leuconostoc的主要種屬，包含三個亞種：腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）、腸膜明串珠菌乳脂亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.cremoris）和腸膜明串珠菌右旋葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dextranicum）及Ln.mesenteroidessubsp.suionicum[16]。

雖然乳酸菌葡聚糖蔗糖酶來源廣泛，但不同種屬來源的葡聚糖蔗糖酶在結構和功能上具有多樣性，進而影響葡聚糖的生物合成過程及功能特性。到目前為止，乳酸菌葡聚糖的生物合成機制仍未得到解析，因此探究葡聚糖蔗糖酶的結構、催化機制及酶學特性，將有助于全面揭示乳酸菌葡聚糖的生物合成機制和構效關系，促進糖生物學的進一步發(fā)展。

1 葡聚糖蔗糖酶的結構及催化機制

1.1 葡聚糖蔗糖酶的結構

葡聚糖蔗糖酶能夠以蔗糖為底物合成不同分子量的α-葡聚糖，不同來源的葡聚糖蔗糖酶的結構具有高度的相似性。同GH13 家族類似，GH70 家族的酶體系構架含有（β/α）8管狀結構[17-18]，合成的多糖一般有兩個特點：分子量大小基本在106Da 以上；糖單元通過不同的共價鍵連接在一起，如α-1,6、α-1,3、α-1,4、α-1,2 等。由α-1,6 鍵連接的多糖，稱為右旋糖酐，能夠合成右旋糖酐的右旋糖苷蔗糖酶主要存在于Leuconostoc中，其中Ln.mesenteroide葡萄糖蔗糖酶能夠催化合成由α-1,6 糖苷鍵連接的葡萄糖[19]。變形聚糖蔗糖酶首先在變形鏈球菌（Streptococcus mutans）AHT 中被發(fā)現(xiàn)，經過它合成的變形聚糖具有α-1,3 糖苷鍵[13]。Ln.mesenteroideNRRL B-1355分泌的交替蔗糖酶可催化由α-1,3 和α-1,6 糖苷鍵交替連接的糖的合成[20]。1990 年科學家們成功在體外表達了高純度的葡萄糖蔗糖酶，并建立出葡聚糖蔗糖酶的立體結構。葡聚糖蔗糖酶含有四個主要功能區(qū)：N 端信號肽（SP）、N 端可變區(qū)（VR）、N 端催化結構域（CD）和位于C 端的葡萄糖結合域（GBD）[21]。

a.N 端信號肽區(qū)：N 端信號肽區(qū)的存在是革蘭氏陽性細菌的一個典型特征。大多數(shù)葡聚糖蔗糖酶分子的末端都有一個由32～38 個氨基酸組成的信號肽。這個區(qū)域是高度保守的，不同來源的葡聚糖蔗糖酶的釋放模式幾乎相同[22]。

b.N 端可變區(qū)域：在N 端信號肽區(qū)之后的是一個由140～261 個氨基酸殘基組成的區(qū)域，因為這個區(qū)域具有高的變異性，人們推測它可能帶有葡聚糖蔗糖酶所特有的序列。然而，也有報道說這個區(qū)域在蛋白質分子中不是特別重要[23]。

c.N 端催化區(qū)：在N 端可變區(qū)域之后的部分是一個高度保守的由950 個左右的氨基酸殘基組成的序列，稱為N 端催化區(qū)，能夠進行蔗糖的催化水解作用。

d.C 端葡萄糖結合域：葡聚糖蔗糖酶的末端存在的一個大約由500 個氨基酸殘基組成的葡萄糖結合域，包含幾個同源的重復序列，這些重復序列的結構和數(shù)量隨葡聚糖蔗糖酶的不同而變化[24]。

1.2 葡聚糖蔗糖酶的催化機制

對于葡聚糖蔗糖酶催化機制，研究者們一直持有不同的觀點，1974 年Robyt 等基于右旋糖酐蔗糖酶的催化反應提出了雙位點插入機制，也叫做還原端延伸機制，在該機制中存在兩個活性位點，一個位點形成葡糖基-酶中間體，另一個位點形成糖鏈-酶中間體，糖鏈-酶中間體中的C1 位會攻擊葡糖基的C6位，形成α-1,6 糖苷鍵，從而使糖鏈得到延伸[25-26]。但該機制并沒有探明如何利用氨基酸殘基進行催化反應。隨著研究的不斷深入，研究人員對這一機制進行了更新和補充，重點關注氨基酸殘基，主要是親和性殘基、酸堿催化殘基和過渡態(tài)穩(wěn)定殘基[27]。在酶的催化反應過程中包括兩個重要途徑：首先，合成葡萄糖基。該步由谷氨酸催化形成一個β-D-葡萄糖苷酶結構，并且釋放出果糖，它的過渡態(tài)穩(wěn)定和殘基穩(wěn)定；其次：去質子化。通過去質子化將糖基分子轉移到活性受體，攻擊糖甘環(huán)的異頭C1 原子和天冬氨酸之間的共價鍵，保守的酪氨酸殘基位于催化中心之外，這種口袋活性部位也存在于多糖核糖酶中[28]。此研究結果不僅從氨基酸水平上解釋了葡聚糖蔗糖酶合成糖的機理，對研究葡聚糖蔗糖酶的結構也具有重要作用，葡聚糖蔗糖酶的催化機制如圖1 所示。

圖1 葡聚糖蔗糖酶催化機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the catalysing mechanism of glucansucrase

1.3 葡聚糖蔗糖酶的應用

乳酸菌分泌的葡聚糖蔗糖酶可催化胞外同源多糖如葡聚糖、果聚糖等的合成。經它合成分泌的右旋糖酐是凝膠柱的主要成分，在醫(yī)學上也是一些藥物的良好載體，在肝臟移植中是肝臟運輸途中良好的保護液，它還能抗氧化、抗腫瘤，預防腫瘤的發(fā)生和惡化[29]。最近的報告表明，乳酸菌葡聚糖蔗糖酶合成的胞外多糖含有磷酸基團和硫酸基團等結構，已被證明具有抗炎作用[30]。乳酸菌葡聚糖作為一種新型的天然食品添加劑，能夠調節(jié)腸道微生物的生長，應用在酸奶、奶酪和奶制甜點的工廠發(fā)酵生產中，對產品質地、口感、味道和最終產品的穩(wěn)定性方面起著重要作用[31]。

葡聚糖蔗糖酶不僅能夠水解蔗糖通過葡糖基轉苷作用合成葡聚糖，還能通過酶合成法利用其具有的轉糖基功能，在底物為高濃度的蔗糖時，通過調節(jié)反應條件葡聚糖蔗糖酶能合成一種既耐熱又耐酸的低聚糖，功能性低聚糖不易被消化道分解，能夠在腸道中發(fā)揮獨特的生理功能[32]。通過酶合成法合成的低聚糖是一種潛在的益生元，具有改善糖尿病癥狀、減輕胰島素抵抗、減少腸道炎癥等益處，在營養(yǎng)保健等研究中受到廣泛關注[33]。

2 乳酸菌葡聚糖蔗糖酶產量優(yōu)化

由于乳酸菌葡聚糖蔗糖酶產量較低，限制其工業(yè)化應用，因此提高乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的產量是拓展其應用范圍的基礎。根據菌株特性及酶學性質，提高葡聚糖蔗糖酶的產量可以從不同的角度進行，首先篩選能夠高產葡聚糖蔗糖酶的乳酸菌，豐富產酶菌株來源；其次，通過優(yōu)化菌株產酶條件，提高酶的產量；再者，通過基因工程的方法構建工程菌株，例如利用基因敲除技術切斷菌株分支代謝途徑，利用基因克隆技術構建異源表達菌株等，對乳酸菌來說，不同的培養(yǎng)基組成可以導致合成的葡聚糖蔗糖酶的產量存在顯著差異。本文通過對菌株產酶條件的優(yōu)化以提高葡聚糖蔗糖酶產量的影響進行了總結，如表1 所示。

表1 培養(yǎng)基組成對葡聚糖蔗糖酶產量的影響Table 1 Effect of medium composition on yield of glucansucrase

2.1 培養(yǎng)基組成對葡聚糖蔗糖酶產量的影響

對乳酸菌來說，不同的培養(yǎng)基組成可以導致合成的葡聚糖蔗糖酶的產量存在顯著差異（表1）。碳源是影響乳酸菌產葡聚糖蔗糖酶的一個重要因素，乳酸菌利用糖類，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖等作為碳源生產葡聚糖蔗糖酶[34]。Shukla 等[35]研究不同碳源對戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CRAG3 發(fā)酵產葡聚糖蔗糖酶的影響進行比較，發(fā)現(xiàn)濃度為5%的蔗糖作為碳源時葡聚糖蔗糖酶活性最高。先前的研究中，課題組通過單因素實驗研究不同碳源對Ln.mesenteroideDRP2-19 葡聚糖蔗糖酶產量的影響時發(fā)現(xiàn)，不同的碳源例如葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖等對葡聚糖蔗糖酶的產量影響較大，當?shù)孜餅?%蔗糖時，酶的活性提高了8.4%[36]。張皓等[37]從泡菜中篩選得到了一株產葡聚糖蔗糖酶的菌株Leuconostocsp.NW02，發(fā)現(xiàn)其分泌的葡聚糖蔗糖酶在蔗糖濃度為8%時，菌株生長最好，蔗糖濃度為10%時，酶的產量最大。蔗糖不僅作為菌株生長代謝的碳源，同時作為葡聚糖蔗糖酶的誘導劑，誘導菌株分泌該酶。

氮源也是影響菌株產葡聚糖蔗糖酶的主要因素，Shukla 等[38]探究了氮源對融合魏氏魏氏菌（Wei-ssella confusa）葡聚糖蔗糖酶產量的影響，發(fā)現(xiàn)酵母提取物是菌株產葡聚糖蔗糖酶最有效的氮源，但高濃度的酵母提取物會抑制葡聚糖蔗糖酶的產生。此外，隨著蛋白胨的濃度增加，葡聚糖蔗糖酶的含量先上升后下降。Das 等[39]通過單因素實驗研究了酵母提取物、蛋白胨和牛肉提取物等不同氮源對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）DM5 產葡聚糖蔗糖酶的影響。研究發(fā)現(xiàn)，酵母提取物是菌株產葡聚糖蔗糖酶的最有效氮源。這與其他報道一致，其中的酵母提取物在生產葡糖蔗糖酶過程中作為維生素和氨基酸補充劑的來源[40-41]。

無機鹽是培養(yǎng)基中不可缺少的成分，是影響乳酸菌產葡聚糖蔗糖酶的主要因素。課題組在先前研究中，探究不同因素對Ln.mesenteroideDRP2-19 的葡聚糖蔗糖酶的產量的影響，發(fā)現(xiàn)Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Ca2+、Na+、K+能夠促進Ln.mesenteroideDRP2-19 葡聚糖蔗糖酶的產量，其中在0.2 mmol/L 的Ca2+條件下，葡聚糖蔗糖酶的產量最高，而Hg2+會抑制葡聚糖蔗糖酶的產量[36]。Shukla 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中乙酸鈉的濃度低于0.05%，對葡聚糖蔗糖酶產量沒有影響，當乙酸鈉的濃度超過0.05%時，酶的產量降低，而Sawale 等[42]報道乙酸鈉能夠促進Ln.mesenteroide產生葡聚糖蔗糖酶。磷酸鹽是細菌良好的磷源，在培養(yǎng)基中常加入一些無機鹽也可以調節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓并在培養(yǎng)基中具有緩沖作用。同樣，對于不同種類的磷酸鹽，葡聚糖蔗糖酶的產量也不同。在0.6% K2HPO4下觀察到葡聚糖蔗糖酶產量顯著增加。在不同濃度的乙酸鈉下記錄的酶活性表明，當其濃度為0.6%時酶的產量最大。Shukla等[38]的試驗也顯示出了1.5%（w/v）的K2HPO4對葡聚糖蔗糖酶生產是最佳的，K2HPO4超過1.5%（w/v），葡聚糖蔗糖酶的產量下降。這些鹽可能通過維持三維蛋白質結構，將酶的活性位點保持在穩(wěn)定狀態(tài)，從而提高葡聚糖蔗糖酶的產量[42]。

2.2 培養(yǎng)條件對葡聚糖蔗糖酶產量的影響

除了培養(yǎng)基組成之外，培養(yǎng)條件如pH、搖床轉速、接種量、溫度等都對乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的產量有影響（表2）。先前研究中課題組發(fā)現(xiàn)，不同pH 對菌株DRP2-19 葡聚糖蔗糖酶的產量有不同的影響，在pH6.0 條件下發(fā)酵30 h，葡聚糖蔗糖酶的產量最大。然而，酸性（pH＜4.5）或堿性（pH＞7）條件會抑制菌株產葡聚糖蔗糖酶[36]。趙博[43]在進行產葡聚糖蔗糖酶培養(yǎng)基條件優(yōu)化中研究了培養(yǎng)基pH 對菌株Ln.citreumB-2 產酶能力的影響，發(fā)現(xiàn)在pH 為6.0 時葡聚糖蔗糖酶的酶活最高。這些研究證明偏中性環(huán)境可能更有利于菌株葡聚糖蔗糖酶的合成和積累。因此，通過調整培養(yǎng)基初始pH 或控制發(fā)酵過程中pH 可以有效影響葡聚糖蔗糖酶的產量，在培養(yǎng)過程中，通常向培養(yǎng)基中添加緩沖鹽，使pH 保持在菌種最適生長和代謝物積累的范圍從而提高酶的產量。此外，pH 的改變會影響葡聚糖蔗糖酶活性中心上必需基團的解離程度，從而影響葡聚糖蔗糖酶與底物的結合和催化作用，導致催化產物的含量發(fā)生改變。

表2 培養(yǎng)條件對葡聚糖蔗糖酶產量的影響Table 2 Effect of culture conditions on yield of glucansucrase

搖床轉速不僅會影響菌株發(fā)酵過程中溶氧量，還可能導致細胞發(fā)生裂解。課題組先前研究了不同轉速對菌株DRP105 產生葡聚糖蔗糖酶產量的影響，結果表明菌株在120 r/min 培養(yǎng)時，葡聚糖蔗糖酶產量最高，而在較低轉速下，酶的產量下降[44]，而菌株DRP2-19 在100 r/min 孵育時葡聚糖蔗糖酶的產量達到最大值[36]。接種量影響菌株生長代謝進程，菌株DRP105 在接種量為4%時葡聚糖蔗糖酶的產量達到最大值[44]。劉歡[45]在研究乳酸菌產葡聚糖蔗糖酶的發(fā)酵條件時發(fā)現(xiàn)，當接種量為4%時，葡聚糖蔗糖酶的產量略高于其他條件。

溫度是影響菌株產葡聚糖蔗糖酶的重要因素，乳酸菌生產葡聚糖蔗糖酶的最佳溫度范圍為20～40 ℃[36]。Du 等[44]發(fā)現(xiàn)菌株DRP105 在30 °C 時葡聚糖蔗糖酶的活性最高。課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，菌株DRP2-19 生產葡聚糖蔗糖酶的最佳溫度范圍為25～30 ℃[36]，這可能是由于不同菌株的最適生長條件不同，其生物合成代謝過程不同，從而影響葡聚糖蔗糖酶的分泌。

3 葡聚糖蔗糖酶的分離純化及酶學性質

3.1 葡聚糖蔗糖酶的分離純化

在最適產酶條件下，菌株生長代謝產生并分泌分泌到細胞外葡聚糖蔗糖酶，通過收集發(fā)酵液上清、酶蛋白沉淀、透析、層析純化和濃縮等多個步驟獲得葡聚糖蔗糖酶純品。用來沉淀葡聚糖蔗糖酶的方法包括硫酸銨沉淀、超濾法和聚乙二醇（PEG）沉淀等方法。硫酸銨沉淀也被稱為鹽沉淀，是最普遍用于沉淀葡聚糖蔗糖酶的方法，因為不同蛋白質溶解度不同，可利用不同濃度的鹽溶液來達到沉淀不同蛋白質的目的，這種沉淀方法具有溶解度高，溫度系數(shù)低，蛋白質不容易變性失活等優(yōu)點[46]。聚乙二醇具有良好的水溶性并且與許多有機成分有良好的兼容性。但是聚乙二醇沉淀法易受到過量脂質、離心溫度和pH 變化的影響，且單獨使用時非特異性結合程度高，常與其他方法結合使用[47]。獲得粗酶后需要繼續(xù)利用相關技術進一步分離純化，例如凝膠過濾層析、離子交換層析、超濾濃縮等。Song 等[48]通過聚乙二醇沉淀、離子交換色譜和凝膠過濾分離純化Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶，酶的純度為原來的13.2 倍，回收率為8.7%，蛋白質的比活性為1.4 U/mg。馬亞君[49]利用離子交換層析和Sepharose CL-6B 凝膠層析等方法純化葡聚糖蔗糖酶，最終得到純酶的比酶活由0.15 U/mg 提高到1.27 U/mg，純化倍數(shù)為原來的8.64 倍，蛋白回收率為8.69%。趙博[43]采用經過DEAE-Sepharose FF 等純化步驟處理Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶，最終酶活為（200.01±5.33）U/mL，純化倍數(shù)最終可達（4.31±1.34）倍。Guzman 等[50]將Ln.mesenteroidesIBUN 91.2.98 葡聚糖蔗糖酶固定在物葡聚糖中，并通過超濾濃縮和陰離子交換層析對酶進行純化，純化后的葡聚糖蔗糖酶的比活為335.1 U/mg。

3.2 葡聚糖蔗糖酶的酶學性質

葡聚糖蔗糖酶作為乳酸菌的初級代謝物產物，在發(fā)揮催化特性時易受到多種因素例如溫度，pH，金屬離子等的影響。

3.2.1 溫度對酶活性的影響 溫度不僅影響酶蛋白的活性和催化反應的速率，也會影響酶的穩(wěn)定性。Das 等[39]報道植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）葡聚糖蔗糖酶活性在27 ℃時最大，為2.71 U/mL，當溫度升高到27 ℃以上時，酶活性降低，在20 ℃時，酶活性降低了35%，這可能是由于細胞生長速度較慢，從而導致酶產量降低。Song 等[48]獲得比活力為3.6 U/mg 的Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶，其最適溫度為45 ℃，在50 ℃孵育0.5 h 后，葡聚糖蔗糖酶的殘余活性約為40%。馬亞君[49]在探究羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）葡聚糖蔗糖酶的酶學性質時發(fā)現(xiàn)，葡聚糖蔗糖酶的在25～45 ℃之間保持著較高的酶活，酶的相對活力保持在70%以上，這說明葡聚糖蔗糖酶在此溫度范圍能保持相對穩(wěn)定的酶活。因為大多數(shù)酶的本質是蛋白質，超過最適溫度，蛋白質就會變性失活，且活性不能恢復，所以在研究乳酸菌生產葡聚糖蔗糖酶時，確定適宜的培養(yǎng)溫度是一個重要問題。

3.2.2 pH 對酶活性的影響 葡聚糖蔗糖酶在pH4.5～5.5 之間保持著較高的酶活。Zhao 等[51]在研究Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶活性時發(fā)現(xiàn)，在pH6.0～8.0時，葡聚糖蔗糖酶的酶活力保持在原來的90%左右，隨著pH 的升高，葡聚糖蔗糖酶的活性逐漸降低。Song 等[48]在研究pH 對Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶活性的影響時發(fā)現(xiàn)，在pH5.0～6.0 的范圍內，葡聚糖蔗糖酶活性最大，酶活力均保持在原來的80%以上。張皓等[37]在研究Leuconostocsp.NW02的葡聚糖蔗糖酶的酶學性質時發(fā)現(xiàn)該酶在pH7.5 時為最適反應pH，在pH7.5～8.0 的條件下保存1 h，酶活力降為原來的60%。可以看出，葡聚糖蔗糖酶在pH 為弱酸性或中性條件下能保持較高的酶活性，具有更好的耐酸性。pH 不僅影響酶蛋白的結構和穩(wěn)定性，而且對酶和底物之間的解離狀態(tài)產生影響。只有在一定pH 范圍內，酶才能表現(xiàn)較高的催化活性。

3.2.3 金屬離子對酶活性的影響 金屬離子與酶的活性中心作用進而對酶產生激活或抑制效應。先前研究發(fā)現(xiàn)，K+、Na+、Ca2+、Mn2+、Mg2+和Cr+對Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶具有明顯的刺激作用，其中Ca2+和Mn2+可顯著促進葡聚糖蔗糖酶的活性，其中Ca2+對酶活的促進作用達到了250%[51]。馬亞君[49]在探究金屬離子對葡聚糖蔗糖酶活性的影響時發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Fe2+和Zn2+能夠提高葡聚糖蔗糖酶的活性，其中Ca2+對酶活的影響最大，酶活提高了接近4 倍，此外Cu2+、Al3+和Fe3+對酶活有抑制作用。Song 等[48]發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mn2+和Co2+在內的幾種雙電荷離子激活Ln.citreumSK24.002葡聚糖蔗糖酶的活性，其中Mn2+存在下酶活提高了1.2 倍，K+、Ba2+、Mg2+和Ni2+離子幾乎不影響酶活性，而Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Al3+離子對酶有抑制作用，證明該酶是一種金屬激活酶。Ca2+與酶的活性中心作用，是影響葡聚糖蔗糖酶活性的重要金屬離子。

3.2.4 有機溶劑和化學抑制劑對酶活性的影響 有機溶劑和化學抑制劑也會在一定程度上抑制酶的活性，大多數(shù)有機溶劑可以通過破壞它們的結構，從而抑制酶活性。先前研究證明，有機溶劑除了苯對Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶的活性幾乎沒有影響之外，甲醇、乙醇、乙腈等均對葡聚糖蔗糖酶的活性有抑制作用[51]。Song 等[48]探究有機溶劑對Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶的活性影響，發(fā)現(xiàn)除丙酮和正己烷存在外，葡聚糖蔗糖酶活性隨著有機溶劑濃度的增加而降低。有機溶劑量增加不僅能夠引起pH 變化，還能改變酶的催化活性構象。Girard等[52]研究同樣表明，Ln.mesenteroidesNRRL B-512F 葡聚糖蔗糖酶的活性與有機溶劑性質有關，20%乙腈，50%DMF、丙酮或乙醇和90%二甲基亞砜可以使酶活減少90%。表面活性劑和化學抑制劑可以通過影響氨基酸的結構而影響酶的活性，幾乎所有的化學抑制劑和表面活性劑都對葡聚糖蔗糖酶的活性具有抑制作用，例如十二烷基硫酸鈉、EDTA、SDS、DTT 和β-ME，且隨著化學抑制劑和表面活性劑濃度的增加，酶的活性急劇下降，在濃度為5 mmol/L 和25 mmol/L 時酶活極低[51]。研究表明，EDTA 可以和一些金屬離子形成穩(wěn)定的絡合物破壞酶的活性中心，然而是否會影響到葡聚糖蔗糖酶的催化特性進而影響到胞外多糖的合成，仍然是未來需要探究的問題。

4 結論與展望

葡聚糖蔗糖酶催化蔗糖，產生具有良好生物活性和較高利用價值的糖類化合物，在糖生物學研究領域和制糖工藝中受到高度重視。從可再生原料中，通過自然反應可以生產各種類型的右旋糖酐、葡萄糖基化的寡糖和葡萄糖基化的衍生物，為葡聚糖蔗糖酶的結構和功能之間關系的研究以及蛋白質工程技術的不斷發(fā)展提供了幫助，并且使葡聚糖蔗糖酶的功能得到了明顯的開發(fā)和利用。新開發(fā)的葡聚糖蔗糖酶能夠進行同類型的天然酶無法催化的反應，并具有新的特性，使這種催化工具能夠用于生產更廣泛的生物活性糖，如抗生素、激素、生物堿等。為了擴大葡聚糖蔗糖酶在生物合成中的應用，在今后的研究中可以利用基因工程方法改變酶的功能的突變基因，使其與現(xiàn)有工程乳酸菌的染色體DNA 進行同源重組，從而找到具有葡聚糖蔗糖酶的有效工程乳酸菌。此外，還可以通過對葡聚糖蔗糖酶的氨基酸組成進行分析，改變酶蛋白的氨基酸組成，從中可以推測出催化過程中酶的結構和功能之間的關系。除了對酶在生物合成中的應用的探索外，另一個困難是缺乏關于酶系統(tǒng)動力學的知識，這對于快速和主動的酶工程設計是必要的，預測突變對酶結構和動力學的影響仍然是一項具有挑戰(zhàn)性的任務。