蔣孟蓮，徐俊，顏雨豪，楊轉(zhuǎn)珍，楊永泓，康晉梅，陳怡璇，蔡曉洋，李敏

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院/省部共建西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137)

藏藥材俄色葉為薔薇科蘋(píng)果屬植物變?nèi)~海棠Malus toringoides (Rehd.)Hughes或花葉海棠Malus transitoria(Batal.)Schneid.的干燥葉及葉芽[1]，具有攻堅(jiān)化積、除膩滌滯、保肝利膽的功效，為甘孜藏族自治州民間的一味藥食兩用藥材，其藥用和食用歷史悠久。俄色葉藥材始載于《四部醫(yī)典》[2]，現(xiàn)已被《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版)[1]收載。俄色葉中主要含有黃酮類(lèi)成分，變?nèi)~海棠葉中總黃酮含量高于花葉海棠，且變?nèi)~海棠在四川省甘孜州地區(qū)的資源蘊(yùn)藏量遠(yuǎn)大于花葉海棠，綜合成分含量和資源蘊(yùn)藏量，為保證俄色葉的可持續(xù)發(fā)展，因此本研究選擇變?nèi)~海棠為研究對(duì)象。目前從俄色葉中已分離鑒別出20余種化合物，其黃酮類(lèi)成分主要包括金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素、蘆丁、紫云英苷[3- 5]等。其中根皮苷、根皮素、槲皮素具有降血糖、抗氧化、保肝[6- 8]、降血脂[9- 10]等作用。俄色葉中總黃酮含量約為同科屬植物西府海棠葉中的2倍[11]，其根皮苷含量約為湖北海棠葉中的6倍[12]，為尖嘴林檎葉中的33倍[13]。因此俄色葉的主要活性成分為黃酮類(lèi)成分。

隨著中藥配方顆粒需求日益增高，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局制定了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見(jiàn)稿)》，對(duì)中藥配方顆粒的制備工藝進(jìn)行整體規(guī)定。但是各個(gè)生產(chǎn)企業(yè)僅根據(jù)自身的經(jīng)驗(yàn)和企業(yè)現(xiàn)有的設(shè)施、輔料等進(jìn)行具體品種生產(chǎn)，沒(méi)有統(tǒng)一生產(chǎn)工藝參數(shù)，導(dǎo)致企業(yè)生產(chǎn)的同品種配方顆粒在規(guī)格、療效上存在差異[14]。因此對(duì)中藥配方顆粒制備工藝進(jìn)行研究，并建立具體品種生產(chǎn)工藝具有重要意義，從而保障藥品質(zhì)量穩(wěn)定和療效。因此，本研究采用單因素結(jié)合Box- Behnken響應(yīng)面法，篩選俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒的最佳提取工藝，為配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

俄色葉(變?nèi)~海棠)藥材采集自四川省甘孜州爐霍縣，凈制去除枝干雜質(zhì)得到俄色葉(變?nèi)~海棠)飲片，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為薔薇科蘋(píng)果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoide(Rehd.)Hughes.的干燥葉。

1.2 試劑

綠原酸(批號(hào)：Wkq20042702，四川省維克奇生物科技有限公司)、金絲桃苷(批號(hào)：Wkq21021904，四川省維克奇生物科技有限公司)、異槲皮苷(批號(hào)：Wkq21061105，四川省維克奇生物科技有限公司)槲皮苷(批號(hào)：Wkq21022402，四川省維克奇生物科技有限公司)、根皮素(批號(hào)：Wkq21020808，四川省維克奇生物科技有限公司)、根皮苷(批號(hào)：Wkq20070810，四川省維克奇生物科技有限公司)、槲皮素(批號(hào)：Wkq20061112，四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

1.3 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；BP121S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Sartorius公司)；MD- DG30E103全自動(dòng)煎藥壺(潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司)；BP121S十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ- 500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SCIENTZ- 20F/A冷凍干燥機(jī)(寧波新芝)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)

俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒提取工藝采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法對(duì)9個(gè)質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，綜合分析篩選出最佳參數(shù)，其中出膏率(X1)、總黃酮(X2)、根皮苷(X3)、根皮素(X4)、綠原酸(X5)、金絲桃苷(X6)、異槲皮苷(X7)、槲皮苷(X8)、槲皮素(X9)為指標(biāo)，以各指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最大值作為參照對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到綜合評(píng)分公式：綜合得分(Y)=(X1/X1max)×0.2+(X2/X2max)×0.2+(X3/X3max)×0.3+(X4/X4max)×0.05+(X5/X5max)×0.05+(X6/X6max)×0.05+(X7/X7max)×0.05+(X8/X8max)×0.05+(X9/X9max)×0.05?？傸S酮含量參照俄色葉中藥標(biāo)準(zhǔn)(SCYPBZ2021- 001)項(xiàng)下總黃酮的測(cè)定方法[1]。綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素7種成分含量參照課題組前期建立的含量測(cè)定方法[15]進(jìn)行測(cè)定。

2.2 7種黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件

色譜條件 Insertsil ODS- 3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm )；流動(dòng)相乙腈(A)- 0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0- 5 min，12%- 15%A；5- 15 min，15%- 20% A；15- 28 min，20% A；28- 48 min，20%- 42% A；48- 50 min，42%- 50% A；50- 55 min，50%- 12% A)；體積流量0.7 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別置于不同25 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并定容，制備各單一對(duì)照品母液。分別取一定量的各對(duì)照品母液，置于同一10 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋制成綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.125 mg/mL、0.35 mg/mL、0.86 mg/mL、0.38 mg/mL、9.3 mg/mL、0.01 mg/mL和0.85 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取俄色葉藥材細(xì)粉(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理45 min，放冷，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定混合對(duì)照品溶液、俄色葉供試品溶液和陰性樣品溶液，結(jié)果表明樣品中各成分分離度和理論板數(shù)均較好，且陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

注:A- 混合對(duì)照品,B- 俄色葉樣品,C- 陰性對(duì)照;1- 綠原酸,2- 金絲桃苷,3- 異槲皮苷,4- 槲皮苷,5- 根皮苷,6- 槲皮素,7- 根皮素

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 浸泡時(shí)間考察

參考標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法，取俄色葉飲片50 g，按料液比1：15，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)2次，分別考察浸泡0 min、15 min、30 min、45 min、60 min對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，浸泡30 min后，各成分變化微弱，故確定30 min為最佳浸泡時(shí)間。

表1 不同浸泡時(shí)間考察 %

2.3.2 料液比考察

取俄色葉飲片50 g，浸泡30 min，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)2次，分別考察料液比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同料液比考察 %

表3 不同提取時(shí)間考察 %

由表可知，隨著提取時(shí)間的增加，綜合評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在提取60 min時(shí)綜合評(píng)分最高，故確定60 min為最佳提取時(shí)間。

2.3.4 提取次數(shù)考察

取俄色葉飲片50 g，按料液比1∶15，浸泡30 min，提取45 min，分別考察提取次數(shù)1次、2次、3次對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同提取時(shí)間考察 %

由表可知，隨著提取次數(shù)的增加，綜合評(píng)分逐漸升高，提取次數(shù)為3次時(shí)，綜合評(píng)分最高，故選擇3次為最佳提取次數(shù)。

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步確定提取工藝參數(shù)為取俄色葉飲片加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮60 min；第二次加13倍量水，煎煮60 min；第三次加13倍量水，煎煮60 min，濾過(guò)，即得。

2.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

2.4.1 Box- Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)

響應(yīng)曲面試驗(yàn)以浸泡時(shí)間(X1)、料液比(X2)、提取時(shí)間(X3)、提取次數(shù)(X4)4個(gè)因素作為自變量，利用Design- Expert8.0.6軟件按照Box- Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，得到29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)。以綜合評(píng)分為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析提取工藝的優(yōu)化，得到最佳提取工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 因素設(shè)計(jì)表

表6 Box- Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以提取工藝中綜合得分為因變量，對(duì)浸泡時(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)各因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到二項(xiàng)式擬合的復(fù)相關(guān)系數(shù)r2=0.8872，模型P<0.05，達(dá)顯著水平，說(shuō)明模型擬合度良好，使用此方程可以代替真實(shí)的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。由表7可知，回歸方程失擬性檢驗(yàn)P=0.1913>0.05，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，模型的殘差可能是隨機(jī)誤差產(chǎn)生，可用此模型來(lái)分析預(yù)測(cè)最佳提取工藝。由方差分析得到多元回歸擬合方程為綜合得分=0.71-0.011A+0.013B+5.912E-003C+0.089D+0.024AB+0.029AC-0.045AD+5.639×10- 3BC+5.684×10- 3BD-0.046CD-0.016A2+0.035B2+8.531×10- 3C2-0.027D2。

表7 響應(yīng)面方差分析

從F值的大小可知，單因素對(duì)提取的影響順序?yàn)镈>B>A>C，即提取次數(shù)>料液比>浸泡時(shí)間>提取時(shí)間；且回歸模型中1次項(xiàng)A、B、C不顯著，D顯著；2次項(xiàng)均顯著；交互項(xiàng)AB、AC、BC、BD不顯著，AD、CD顯著，說(shuō)明不同的提取工藝與綜合得分之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。通過(guò)DesignExpert8.0.6軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖，響應(yīng)曲面陡峭程度越大，則對(duì)綜合得分的影響也越大，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于響應(yīng)曲面法不同因素對(duì)綜合得分的影響

根據(jù)響應(yīng)曲面結(jié)果篩選出最佳提取工藝為按料液比1：15加水，浸泡27.85 min，提取3次，每次45 min。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)能耗和其他生產(chǎn)成本控制因素，以及最接近標(biāo)準(zhǔn)湯劑原則，確定更合理的提取工藝，將最佳提取工藝條件修正為取俄色葉飲片加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，濾過(guò)，即得。

2.5 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)“2.3.1”優(yōu)選出的最佳工藝制備3批樣品，測(cè)定樣品中多種成分的含量，并進(jìn)行綜合評(píng)分，見(jiàn)表8。由最佳提取工藝所得提取液的測(cè)定結(jié)果可知，實(shí)測(cè)OD值與預(yù)測(cè)值0.938的相對(duì)誤差較小(3.08%)，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的回歸模型準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化得到的最佳加工工藝重現(xiàn)性好。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 %

3 討論

3.1 俄色葉(變?nèi)~海棠)標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒指標(biāo)成分的選擇

目前《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版)中僅對(duì)俄色葉項(xiàng)下總黃酮和根皮素含量做出規(guī)定，但研究表明，俄色葉中已能分離鑒別出20余種化合物[16]，其黃酮類(lèi)成分根皮苷、根皮素、槲皮素具有多種重要生物活性，因此黃酮類(lèi)成分的含量對(duì)保證俄色葉藥材質(zhì)量和藥效十分重要。本實(shí)驗(yàn)選擇綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素這7個(gè)黃酮類(lèi)成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，能夠更好地評(píng)價(jià)俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒的提取工藝。

3.2 俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒提取工藝的確定

本實(shí)驗(yàn)首先采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)俄色葉配方顆粒提取工藝的浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)四因素進(jìn)行考察，初步確定為浸泡30 min，料液比1：15，提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)3次。標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝研究表明飲片的吸濕率為200%，故在對(duì)料液比進(jìn)行考察時(shí)，針對(duì)飲片吸濕對(duì)水的損耗，第二次加水量均在第一次加水的基礎(chǔ)上減少2倍水。隨后采用響應(yīng)曲面法對(duì)篩選出的提取工藝進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)，分析不同因素對(duì)配方顆粒提取率的綜合影響，結(jié)合現(xiàn)代實(shí)際生產(chǎn)情況，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)確定的條件進(jìn)行修正為取俄色葉飲片加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，濾過(guò)，即得。

綜上分析，本文采用單因素結(jié)合Box- Behnken響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，以7種黃酮類(lèi)成分含量、總黃酮、出膏率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，優(yōu)選俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒最佳提取工藝為：加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，濾過(guò)，合并煎液。四川省藏藥資源豐富，而且在許多高原疾病上面具有顯著優(yōu)勢(shì)，但是目前許多藏藥的研究開(kāi)發(fā)仍較為薄弱，需要加強(qiáng)對(duì)其化學(xué)成分、作用機(jī)制等方面的研究[17]。本文僅對(duì)俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒的提取工藝進(jìn)行了研究，后續(xù)還需建立其配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)方法，以完善整個(gè)俄色葉(變?nèi)~海棠)配方顆粒的質(zhì)量控制體系。