李大偉，許誠，張利明，王春民，夏瑜

（1.蘇州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇蘇州 215004； 2.蘇州市計(jì)量測試院，江蘇蘇州 215100）

液相色譜儀是化學(xué)分析檢測實(shí)驗(yàn)室最常用的一種設(shè)備，在食品檢測領(lǐng)域，主要用于食品營養(yǎng)成分檢測[1]、食品添加劑檢測[2-4]、農(nóng)藥殘留檢測[5-8]、微生物代謝物檢測[9-11]等；此外，在水環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，主要用于陰離子檢測[12]、有機(jī)物質(zhì)檢測[13-14]、污染物質(zhì)檢測[15-16]等。分析檢測實(shí)驗(yàn)室的最終產(chǎn)品就是檢測報(bào)告，然而檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和有效性會直接影響到所出具的檢測報(bào)告的正確性和法律效力[17-18]。為了保證實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，除了外部的能力驗(yàn)證、計(jì)量比對以外，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的儀器設(shè)備期間核查也是一個重要的核查手段。期間核查是檢查被核查對象是否保持原校準(zhǔn)/檢定的狀態(tài)，維持其最佳溯源/測量能力，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)被核查對象的失準(zhǔn)程度，以保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠[19-20]。

實(shí)驗(yàn)室對液相色譜儀的期間核查，可根據(jù)使用需求的具體情況而采取相應(yīng)的核查方法，如用咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品帶入儀器檢測，計(jì)算示值誤差，與判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較；然而很少有人對液相色譜儀計(jì)量性能做過系統(tǒng)的期間核查。筆者參照J(rèn)JG 705—2014《液相色譜儀》并結(jié)合自身的工作經(jīng)驗(yàn)，對液相色譜儀計(jì)量性能的期間核查進(jìn)行了探討。該方法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可為實(shí)驗(yàn)室液相色譜儀管理者提供儀器評價(jià)依據(jù)，同時(shí)也為食品、藥品企業(yè)驗(yàn)證液相色譜儀計(jì)量性能提供參照依據(jù)。

1 期間核查的準(zhǔn)備

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters 2695 型，配備二極管陣列檢測器(2996 PAD)，美國沃特世公司。

液相色譜液體流量計(jì)：5025000 型，英國GJC Instruments公司。

超純水儀：Milli-Q型，美國密理博公司。

丙酮、異丙醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

紫外分光光度計(jì)校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號為GBW(E) 130066，中國計(jì)量科學(xué)研究院。

萘的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：(1) 1.00×10-4g/mL，編號為GBW (E) 130167；(2) 1.00×10-7g/mL，編號為GBW(E) 130168。中國計(jì)量科學(xué)研究院。

甲醇：色譜純，德國默克公司。

1.2 溶液配制

丙酮溶液：丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.1%，準(zhǔn)確量取1 mL丙酮，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加入超純水定容至標(biāo)線?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

異丙醇溶液：異丙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，準(zhǔn)確量取20 mL異丙醇，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加入超純水定容至標(biāo)線。

丙酮-2%異丙醇系列混合溶液：先配制1.0%丙酮-2%異丙醇水溶液，再以此為母液進(jìn)行稀釋。準(zhǔn)確量取1 mL丙酮，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入異丙醇溶液定容至標(biāo)線，即為1.0%丙酮-2%異丙醇水溶液；再分別量取1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL母液，用2%異丙醇溶液定容于10 mL容量瓶中，得丙酮體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的丙酮-2%異丙醇系列混合溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

2 期間核查的實(shí)施

2.1 泵流量設(shè)定值誤差SS和流量穩(wěn)定性SR核查

JJG 705—2014中采用容量瓶收集流動相、秒表計(jì)時(shí)、天平稱量的方法來進(jìn)行測定。該方法的準(zhǔn)確度受較多因素影響，如容量瓶準(zhǔn)確度等級、溫度對容量瓶容量準(zhǔn)確度的影響，以及流動相的揮發(fā)性、秒表的誤差、天平的誤差、天平室的溫濕度的影響等，且該法操作繁瑣。變更方法：在流動相出口處采用兩通連接液體流量計(jì)，在液相色譜儀液晶面板或者工作站上設(shè)定流量分別為0.5、1.0、1.2 mL/min，從液體流量計(jì)上讀取流量測定值，測量數(shù)據(jù)見表1。測量相對誤差SS和穩(wěn)定性SR分別按式(1)、式(2)計(jì)算：

表1 流量設(shè)定值、實(shí)測值、相對誤差、穩(wěn)定性Tab.1 Set value, measured value, relative error and stability of flow

FS——流量設(shè)定值，mL/min；

Fmax——流量3次測量值的最大值，mL/min；

Fmin——流量3次測量值的最小值，mL/min。

2.2 梯度誤差核查

參照J(rèn)JG 705—2014設(shè)置色譜條件。流動相：A通道為超純水，B通道為0.1%(體積分?jǐn)?shù))丙酮溶液，流量為2 mL/min；分析波長：254 nm。用兩通代替色譜柱。

開機(jī)后，以A通道(超純水)沖洗系統(tǒng)，待基線平穩(wěn)后執(zhí)行梯度洗脫程序，JJG 705—2014中未給出梯度洗脫程序的時(shí)間，筆者給出了如表2 所示的梯度洗脫程序。執(zhí)行梯度洗脫程序時(shí)，利用色譜工作站軟件設(shè)置空針進(jìn)樣，并記錄色譜圖，即梯度變化曲線如圖1所示。

圖1 流動相B不同體積分?jǐn)?shù)時(shí)的信號值Fig.1 Signal values of different volume fraction mobile phase B

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

重復(fù)測量2次，記錄每一段階梯對應(yīng)的Y軸響應(yīng)信號值，第一次測量的6 段階梯信號值L1i分別為0.000 03、0.037 92、0.076 00、0.114 05、0.151 85、0.189 88，用后一個測定值減去前一個測定值得到5組數(shù)據(jù)，即(L1i-L1(i-1))的值；同理得出第二次測量的6段階梯信號值L2i和(L2i-L2(i-1))數(shù)據(jù)，利用式(3)～式(5)分別計(jì)算第i段階梯響應(yīng)信號值的平均值■Li、5段階梯響應(yīng)信號值的總平均值■Li及某段階梯的梯度誤差Gi。

梯度誤差測量值及計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 梯度誤差測量值及計(jì)算結(jié)果Tab.3 Measured values and calculated results of gradient error

2.3 波長示值誤差和重復(fù)性核查

JJG 705—2014中，用注射器將紫外分光光度計(jì)校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液從檢測器入口注入樣品池中，采用直接注入法，標(biāo)準(zhǔn)溶液用量大且容易造成檢測器污染，故對方法進(jìn)行如下變更：流動相：A 通道，100%超純水，流量為1 mL/min；掃描波長：210～400 nm；用兩通代替色譜柱。進(jìn)樣10 μL紫外分光光度計(jì)校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)的光譜掃描圖如圖2所示。

圖2中，波峰(或波谷)對應(yīng)的波長與參考波長之差為波長示值誤差。每個波長重復(fù)測量3 次，其中最大值與最小值之差為波長重復(fù)性，測量結(jié)果見表4。

表4 波長示值誤差與波長重復(fù)性核查結(jié)果Tab.4 Verification result of wavelength indication error and wavelength repeatability

2.4 基線噪聲、基線漂移和最小檢測濃度核查

參照J(rèn)JG 705—2014，在液相色譜儀工作站上測量出基線噪聲、30 min 內(nèi)基線漂移分別為1.6×10-4、8×10-4，選用C18色譜柱，以100%甲醇為流動相，流量設(shè)為1.0 mL/min，檢測器波長設(shè)置為254 nm，進(jìn)樣1.00×10-7g/mL 萘的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，記錄萘-甲醇色譜峰高，按照公式(6)計(jì)算最小檢測質(zhì)量濃度：

式中：ρL——最小檢測質(zhì)量濃度，g/mL；

Nd——基線噪聲；

ρ——萘的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，g/mL；

V——進(jìn)樣體積，V=10 μL；

H——萘-甲醇色譜峰高；

20——標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣體積，μL。

實(shí)驗(yàn)測得1.00×10-7g/mL 的萘-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰高為725×10-6，代入式(6)，計(jì)算得ρL為2.2×10-8g/mL。

2.5 線性范圍核查

JJG 705—2014中，用注射器直接向檢測池中注射丙酮-2%異丙醇溶液，手動注入的速度難以保持恒定一致，結(jié)果重現(xiàn)性較差，并且手動注入容易造成檢測器污染。變更方法如下：流動相：2%異丙醇溶液，流量為1 mL/min；分析波長：254 nm；用兩通代替色譜柱。

選擇丙酮-2%異丙醇系列混合溶液(丙酮體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%)分別進(jìn)樣測定，進(jìn)樣體積均為10 μL，色譜圖如圖3 所示，得到的線性范圍數(shù)據(jù)如表5所示。

圖3 丙酮-2%異丙醇水溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of acetone-2% isopropyl alcohol aqueous solution

表5 線性范圍核查試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Verification result of linear range

表5 中，以丙酮體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和對應(yīng)的色譜峰面積平均值進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=1 246.8x-7.24，利用線性方程計(jì)算丙酮體積分?jǐn)?shù)大于0.5%各濃度點(diǎn)的色譜峰面積，并與對應(yīng)的色譜峰面積測量平均值比較，計(jì)算出相對誤差，以相對誤差大于5%所對應(yīng)的丙酮體積分?jǐn)?shù)作為檢測上限φH，由表5可知φH為0.6%。參照文獻(xiàn)[21]，將低濃度(丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.1%)丙酮-2%異丙醇溶液稀釋至100倍體積后進(jìn)樣(10 μL)測定，測得色譜峰高為159×10-6，基線噪聲為6×10-5，按照式(7)計(jì)算的φL為3.8×10-6，根據(jù)JJG 705—2014，以φH/φL作為線性范圍，計(jì)算結(jié)果為1 578.9。

式中：φL——丙酮最小檢測體積分?jǐn)?shù)，%；

Nd——基線噪聲；

φ——丙酮-2%異丙醇溶液稀釋后丙酮的體積分?jǐn)?shù)，φ=1.0×10-5；

V——進(jìn)樣體積，V=10 μL；

H——萘-甲醇色譜峰高；

20——標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣體積，μL。

2.6 定性、定量重復(fù)性核查

按照2.4 色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣質(zhì)量濃度為1.00×10-4g/mL的萘-甲醇溶液6次，記錄色譜峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算對應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表6。定性重復(fù)性用色譜保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；定量重復(fù)性用色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。由表6可知，定性重復(fù)性為0.5%，定量重復(fù)性為0.8%。

表6 定性、定量重復(fù)性核查試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Verification result of qualitative and quantitative repeatability

3 核查結(jié)果判定

綜合泵流量設(shè)定值誤差、流量穩(wěn)定性、梯度誤差、波長示值誤差、波長重復(fù)性、基線噪聲、基線漂移、最小檢測質(zhì)量濃度、線性范圍、定性重復(fù)性、定量重復(fù)性11 個方面的核查數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，以上11 個方面的核查結(jié)果均符合JJG 705—2014 中對液相色譜儀計(jì)量性能的要求(表7)。

表7 液相色譜儀計(jì)量性能技術(shù)要求Tab.7 Technical requirements for metrological performance of liquid chromatography