王巍，張強(qiáng)，楊武杰，郝季，陳九妹，安悅言，鞠成國，2，竇德強(qiáng)

［1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600； 2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地（遼寧），遼寧大連 116600］

訶子為使君子科植物訶子(Terminalia chebula Retz.)或絨毛訶子(T.chebula Retz.var.tomentella Kurt.)的干燥成熟果實(shí)，為《中華人民共和國藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》) 2020 年版一部收載。訶子味苦、酸、澀，性平，歸肺、大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽的功效[1]。訶子化學(xué)成分主要為鞣質(zhì)類[2]，其中以訶黎勒酸、訶子酸含量較高[3-5]。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，訶黎勒酸、訶子酸具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及降血糖的作用[6-9]。趙鹿等[2]從植物親緣學(xué)及化學(xué)成分特有性、傳統(tǒng)功效、藥性、藥動(dòng)學(xué)、新臨床用途和化學(xué)成分可測(cè)性等多個(gè)方面預(yù)測(cè)包括訶黎勒酸、訶子酸在內(nèi)的4 個(gè)化學(xué)成分為訶子的質(zhì)量標(biāo)志物。《中國藥典》中訶子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺少含量測(cè)定的要求，這對(duì)訶子藥材的質(zhì)量控制造成了一定的缺憾。同時(shí)現(xiàn)有文獻(xiàn)也未見對(duì)訶黎勒酸、訶子酸同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道，多是對(duì)其它鞣質(zhì)類成分進(jìn)行測(cè)定[10-11]。筆者建立了測(cè)定訶子藥材中訶黎勒酸、訶子酸含量的高效液相色譜法，作為《中國藥典》2020年版一部中訶子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-16型，日本島津公司。

電子天平：FA1004B 型，感量為0.1 mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

電子天平：METTLER AE240 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

醫(yī)用超聲波清洗器：KQ-250E 型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

訶黎勒酸、訶子酸對(duì)照品：經(jīng)HPLC法[12-13]檢測(cè)，純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不小于98%，自制。

乙腈：色譜純，美國天地試劑公司。

甲醇、甲酸：均為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

訶子藥材：市售，產(chǎn)地為云南，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋慧鵬副教授鑒定為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實(shí)。

實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Dikma Platisil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪科馬科技有限公司)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液-乙腈-甲醇(體積比為78∶16∶6)，等度洗脫，流量為1 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：訶黎勒酸、訶子酸質(zhì)量濃度分別為0.410、0.455 mg/mL。精密稱取訶黎勒酸、訶子酸對(duì)照品適量，加入50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈溶液溶解，并稀釋、定容。

樣品溶液：取訶子藥材，去核，留果肉，粉碎，過孔徑為250 μm (65目)篩。精密稱取0.1 g，精密加入50%乙腈溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取30 min，冷卻至室溫，以提取溶劑補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至標(biāo)線，搖勻，再經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取混合對(duì)照品溶液、樣品溶液，按照1.2 色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算訶子藥材中訶黎勒酸、訶子酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式選擇

取訶子藥材，去核，留果肉，粉碎，過孔徑為250 μm 篩。精密稱取2 份，每份0.1 g，精密加入50%乙腈溶液25 mL，稱定質(zhì)量，分別超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取30 min、加熱回流30 min；放冷，以提取溶劑補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至標(biāo)線，搖勻，再經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)行測(cè)定。超聲提取樣品測(cè)得訶黎勒酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.95%，訶子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.30%；加熱回流30 min提取樣品測(cè)得訶黎勒酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.27%，訶子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.15%。說明超聲提取效果更佳，因此提取方式應(yīng)以超聲提取為宜。

2.2 提取溶劑選擇

取訶子藥材，去核，留果肉，粉碎，過孔徑為250 μm 篩。精密稱取21 份，每份0.1 g，分別精密加入25 mL 的水、不同濃度的甲醇溶液或不同濃度的乙腈溶液，其余步驟同上，結(jié)果見表1。

表1 不同提取溶劑時(shí)訶黎勒酸和訶子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination results of mass fractions of chebulagic acid and chebulinic acid in different extraction solvents %

由表1可知，乙腈的提取率高于甲醇，其中50%乙腈溶液對(duì)兩種成分的提取量均較高，因此提取溶劑選擇50%乙腈溶液。文獻(xiàn)[14-15]對(duì)訶子化學(xué)成分分析均采用70%甲醇溶液作為提取溶劑，筆者在制備訶黎勒酸、訶子酸對(duì)照品時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者在甲醇中不穩(wěn)定，會(huì)與溶劑發(fā)生可逆的絡(luò)合反應(yīng)，因此采用甲醇為溶劑進(jìn)行提取對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響較大。

2.3 色譜條件優(yōu)化

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

分別對(duì)訶黎勒酸、訶子酸對(duì)照品進(jìn)行200～400 nm 吸收光譜掃描，結(jié)果表明，訶黎勒酸最大吸收波長(zhǎng)為278 nm，訶子酸最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，最終檢測(cè)波長(zhǎng)確定為280 nm。

2.3.2 流動(dòng)相

由于樣品提取試劑為乙腈，首先選擇乙腈-水作為淋洗液，發(fā)現(xiàn)在不同配比條件下1，2，3，4，6-O-五沒食子?；咸烟桥c訶子酸均無法分離，表明1，2，3，4，6-O-五沒食子?；咸烟桥c訶子酸在乙腈中選擇性相似，色譜行為相近。在洗脫體系中加入少量甲醇，結(jié)果表明，隨著甲醇加入量的增加，兩者的分離度逐漸增大，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，兩者可以達(dá)到完全分離，且訶黎勒酸與訶子酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，故最終選擇以水-乙腈-甲醇三相組成淋洗液。

取訶子藥材，按1.3 方法制備樣品溶液，對(duì)淋洗液組成進(jìn)行優(yōu)化，考察兩種目標(biāo)成分的色譜分離效果，兩種目標(biāo)成分保留時(shí)間、色譜分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)選擇序號(hào)為1、3、5的流動(dòng)相時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸的分離度較小；選擇序號(hào)為4的流動(dòng)相時(shí)，訶子酸的保留時(shí)間過長(zhǎng)；選擇序號(hào)為7 的流動(dòng)相時(shí)，拖尾因子變大；序號(hào)為6 的流動(dòng)相中增加了甲酸體積分?jǐn)?shù)，但對(duì)整體色譜行為影響不大。綜合考慮，序號(hào)為2 的流動(dòng)相效果最佳，故流動(dòng)相選擇0.1%的甲酸水溶液-乙腈-甲醇(體積比為78∶16∶6)。

表2 不同流動(dòng)相組成時(shí)訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.2 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid under different mobile phase compositions

2.3.3 淋洗液流量

取訶子藥材，按1.3方法制備樣品溶液，分別選擇不同淋洗液流量進(jìn)行試驗(yàn)，考察兩種目標(biāo)成分的色譜分離效果，兩種目標(biāo)成分保留時(shí)間、色譜分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子結(jié)果見表3。由表3可知，淋洗液流量大于1.0 mL/min時(shí)，訶黎勒酸分離度低于2.0；當(dāng)淋洗液流量小于1.0 mL/min時(shí)，訶子酸的保留時(shí)間過長(zhǎng)。綜合考慮，淋洗液流量選擇1.0 mL/min。

表3 不同淋洗液流量時(shí)訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.3 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different flow rates of eluent

2.3.4 進(jìn)樣體積

取訶子藥材，按1.3 方法制備樣品溶液，分別選擇不同進(jìn)樣體積進(jìn)行試驗(yàn)，考察兩種目標(biāo)成分的色譜分離效果，兩種目標(biāo)成分色譜分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子結(jié)果見表4。由表4可知，當(dāng)進(jìn)樣體積不大于5 μL 時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸的分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)均大于8 000，拖尾因子均小于1.2；但進(jìn)樣體積為3 μL 太小，誤差較大；當(dāng)進(jìn)樣體積為10 μL 時(shí)，理論塔板數(shù)顯著降低；當(dāng)進(jìn)樣體積為20 μL 時(shí)，訶黎勒酸與訶子酸前延峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，不能滿足定量分析要求。綜合考慮，選擇進(jìn)樣體積為5 μL。

表4 不同進(jìn)樣體積時(shí)訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.4 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different injection volumes

2.3.5 柱溫

取訶子藥材，按1.3 方法制備樣品溶液，分別選擇不同柱溫進(jìn)行試驗(yàn)，考察兩種目標(biāo)成分的色譜分離效果，兩種目標(biāo)成分保留時(shí)間、色譜分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子結(jié)果見表5。由表5可知，在30～40 ℃范圍內(nèi)隨著柱溫的升高，訶黎勒酸、訶子酸保留時(shí)間逐漸減小，其它指標(biāo)無明顯變化，為減少儀器運(yùn)行的損耗，選擇柱溫為30 ℃。

表5 不同柱溫時(shí)訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.5 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different column temperatures

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、樣品溶液分別按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，在樣品溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖中訶黎勒酸、訶子酸色譜峰保留時(shí)間一致，且實(shí)現(xiàn)基線分離。訶黎勒酸保留時(shí)間為13.507，分離度為2.2，理論塔板數(shù)為8 860，拖尾因子為1.16；訶子酸保留時(shí)間為33.711，分離度為3.2，理論塔板數(shù)為11 087，拖尾因子為1.20。

圖1 訶黎勒酸、訶子酸混合對(duì)照品溶液、訶子樣品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed reference solutionof chebulagic acid and chebulinic acidand sample solution of Terminalia Chebula Retz.

2.5 線性方程、檢出限與定量限

取混合對(duì)照品溶液，以50%乙腈溶液逐級(jí)稀釋成訶黎勒酸質(zhì)量濃度分別為0.205 0、0.102 5、0.051 3、0.025 6、0.012 8、0.006 4 mg/mL，訶子酸質(zhì)量 濃 度 分 別 為0.227 5、0.113 8、0.056 9、0.028 4、0.014 2、0.007 1 mg/mL 的系列混合對(duì)照品工作溶液。按1.2 色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以目標(biāo)物質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得訶黎勒酸的線性方程為y=1 591 948x-25 820，相關(guān)系數(shù)為0.999 6；訶子酸的線性方程為y=2 267 031x-61 935，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。表明訶黎勒酸、訶子酸的質(zhì)量分別在0.032 03～1.025 μg、0.035 55～1.137 μg 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

將質(zhì)量濃度最低點(diǎn)的混合對(duì)照品溶液以50%乙腈溶液逐級(jí)稀釋，分別進(jìn)樣檢測(cè)，以信噪比為3∶1時(shí)對(duì)應(yīng)的溶液中目標(biāo)物的質(zhì)量為方法檢出限，以信噪比為10∶1 時(shí)對(duì)應(yīng)的溶液中目標(biāo)物的質(zhì)量為定量限。訶黎勒酸的檢出限為2.67 ng，定量限為8.00 ng；訶子酸的檢出限為4.44 ng，定量限為11.85 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取訶子藥材，按1.3 方法平行制備6 份樣品溶液，按1.2色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算訶黎勒酸和訶子酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表6。由表6可知，訶黎勒酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.9 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%；訶子酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.9 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%。表明該方法精密度良好。

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of precision test

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取訶子藥材樣品粉末，按照所建方法測(cè)定訶黎勒酸、訶子酸含量，然后取約0.05 g樣品，共9份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入相當(dāng)于藥材中目標(biāo)物含量約80%、100%和120%的訶黎勒酸、訶子酸對(duì)照品，每個(gè)劑量3 份，按1.3 方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算兩種目標(biāo)成分的回收率，結(jié)果列于表7。由表7可知，訶黎勒酸、訶子酸的回收率均在97%～103%之間，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表7 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of spiked recovery test

3 結(jié)語

建立高效液相色譜法測(cè)定中藥材訶子中訶黎勒酸和訶子酸的含量，該方法穩(wěn)定可靠，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，精密度及準(zhǔn)確度好，可對(duì)《中國藥典》2020年版一部中訶子含量測(cè)定項(xiàng)進(jìn)行補(bǔ)充，以利于訶子藥材的質(zhì)量控制。