郭新穎

（南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226001）

組胺是由組氨酸在脫羧酶的作用下產(chǎn)生的一種有機(jī)含氮化合物。天然寄生的微生物菌會通過繁殖分泌出組胺酸脫羧酶，并與生物體內(nèi)的組胺酸轉(zhuǎn)化為組胺，因此組胺更易存在于蛋白質(zhì)含量豐富的魚類水產(chǎn)品中[1-2]。已有研究報(bào)道，金槍魚、鯖魚、秋刀魚等魚類及其制品是組胺含量較高的食品之一[3-4]。組胺不慎被人體攝入將引發(fā)健康風(fēng)險(xiǎn)，中毒癥狀輕者表現(xiàn)為惡心、嘔吐、頭痛、心悸、暈眩及出疹，重者會引發(fā)哮喘及突發(fā)心臟疾病[5-6]。目前一些國家已經(jīng)規(guī)定了組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，如美國規(guī)定水產(chǎn)品及其制品中組胺含量不得超過50 mg/kg，歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg，中國規(guī)定鮐魚中組胺含量不得超過1 000 mg/kg，其它海產(chǎn)魚類中不超過300 mg/kg。我國是水產(chǎn)品養(yǎng)殖和進(jìn)出口大國，水產(chǎn)品質(zhì)量安全關(guān)系到國際貿(mào)易與人體健康，因此對水產(chǎn)品中的組胺進(jìn)行定量檢測極其重要。

目前，國內(nèi)外關(guān)于魚類等水產(chǎn)品中組胺的檢測方法多采用高效液相色譜(HPLC)法[7-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法[11-14]等。其中，UPLC-MS/MS法儀器昂貴且對人員技術(shù)要求高，在一般基層檢測機(jī)構(gòu)中難以普及應(yīng)用；而HPLC 法儀器價(jià)格適中，操作簡便，分析快速，廣泛應(yīng)用于分析檢測生物胺類化合物，成為測定組胺的常用方法之一。組胺的樣品處理方法主要為固相萃取法[15-16]和柱前衍生法[17-18]。商品化固相萃取柱不僅價(jià)格高，還需要大量有機(jī)溶劑進(jìn)行活化、淋洗、洗脫，過程繁瑣，耗費(fèi)人力物力；另外，魚肉制品基質(zhì)復(fù)雜，樣品中組胺易分解，無法保證試劑衍生化效率，因此有必要開發(fā)簡單易操作、可靠環(huán)保、衍生效率高的樣品處理方法。

筆者建立了一種試劑衍生化效率高、衍生步驟簡單的柱前衍生-高效液相色譜法，用于測定海魚中的組胺含量，該方法可為水產(chǎn)品中組胺的含量檢測及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，帶有紫外-可見檢測器裝置，美國安捷倫科技有限公司。

分析天平：AG245 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。離心機(jī)：Primo B型，美國賽默飛科技有限公司。組胺二鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1，7-二氨基庚烷、丹磺酰氯：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別大于98.0%和99.0%，上海安譜試劑有限公司。

乙腈：色譜純，德國默克公司。

乙酸、鹽酸、氨水、乙醚、正己烷、氫氧化鈉、乙酸銨：均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

采用彩色多普勒超聲診斷儀（型號：飛利浦CV350），選用線陣探頭，頻率為10～13MHz。指導(dǎo)患者采取仰臥位，將頸部暴露，墊高肩部，后仰頭頸部，盡可能的偏向檢測對側(cè)。詳細(xì)檢查患者斑塊大小、范圍、明確斑塊位置、內(nèi)徑、內(nèi)膜、頸動(dòng)脈血管走形、起點(diǎn)以及起源等。根據(jù)斑塊的回聲情況判斷斑塊的性質(zhì)。以彩色多普勒技術(shù)顯示出血流方向，判斷有無充盈，血流信號有無逆轉(zhuǎn)，以PW（脈沖多普勒）檢查各節(jié)段血流頻譜，測量PSV（收縮期峰值流速）、EDV（舒張期峰值流速）、Vm（平均流速）、RI（阻力指數(shù)）。局部狹窄的地方，需要測量該部位舒張末期最大峰值、收縮期最大峰值、狹窄處管腔內(nèi)徑，對狹窄程度進(jìn)行全面評估。

海魚樣品：鲅魚，市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 000 μg/mL，精確稱取組胺二鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品0.016 6 g (折算為生物胺單體量0.010 0 g)，加入0.1 mol/L 鹽酸溶液，溶解并定容至10 mL，混合均勻。

組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液：100 μg/mL，吸取1.0 mL組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入0.1 mol/L 的鹽酸，稀釋并定容至10 mL，混合均勻。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：10 μg/mL，精確稱取1，7-二氨基庚烷0.100 g，加入0.1 mol/L 鹽酸溶液，溶解并定容至10 mL，混合均勻。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液：200 μg/mL，準(zhǔn)確吸取200 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容至10 mL，混合均勻。

系列組胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液10、25、50、100、150、250、500 μL，各加入250 μL 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，用0.1 mol/L 鹽酸溶液定容至1.0 mL，得到質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 μg/mL 含內(nèi)標(biāo)的系列組胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；紫外檢測波長：254 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A 相為含0.1% (體積分?jǐn)?shù))乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液-乙腈(體積比為1∶9)，B相為含0.1% (體積分?jǐn)?shù))乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈(體積比為9∶1)，流量為0.8 mL/min；淋洗方式：梯度洗脫[19]。

1.4 樣品處理

樣品的提取和凈化：參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》進(jìn)行。

空白樣品溶液：準(zhǔn)確稱取不含目標(biāo)組分的空白樣品基質(zhì)，同法制備空白樣品溶液。

1.5 測定方法

在1.3儀器工作條件下，對系列組胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以組胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜峰面積響應(yīng)值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。樣品中的組胺采用色譜峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

分別選擇ZORBAX Eclipse XDB C18柱和Dikma Diamonsil C18柱兩種C18色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)物色譜保留時(shí)間基本一致，且目標(biāo)峰附近無干擾峰，色譜峰分離良好，峰形對稱完整，說明在相同的測試條件下，選擇通用型C18色譜柱均可滿足測試要求，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇色譜柱。

2.2 衍生條件選擇

2.2.1 衍生試劑

分別選擇丹磺酰氯和苯磺酰氯對樣品中的組胺進(jìn)行衍生試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用丹磺酰氯衍生試劑時(shí)，組胺衍生物和內(nèi)標(biāo)物均能夠正常出峰，且目標(biāo)組分的線性良好，而苯磺酰氯衍生劑在相同使用劑量和測試條件下未能檢出衍生產(chǎn)物，說明丹磺酰氯的衍生效果好，適于本方法組胺衍生，因此選擇丹磺酰氯作為衍生試劑。

2.2.2 衍生溫度

分別選擇在25、30、40、50、55、60 ℃條件下進(jìn)行衍生試驗(yàn)，空白加標(biāo)樣品中組胺的回收率列于表1。由表1 可知，當(dāng)溫度不高于50 ℃時(shí)，組胺的回收率極低，衍生效果差；當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，組胺的回收率較高，衍生效果較好；當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，組胺的回收率為98.4%。說明低溫不利于組胺鹽與衍生試劑的衍生反應(yīng)，最終將反應(yīng)溫度設(shè)定為60 ℃。

表1 不同衍生溫度下加標(biāo)樣品中組胺的回收率Tab.1 Recoveries of histamine in spiked samples at different derivative temperatures

2.2.3 衍生反應(yīng)時(shí)間

分別選擇衍生反應(yīng)時(shí)間為20、30、40、45、50、60 min 進(jìn)行試驗(yàn)，空白加標(biāo)樣品中組胺的回收率列于表2。

表2 不同衍生反應(yīng)時(shí)間時(shí)加標(biāo)樣品中組胺的回收率Tab.2 Recoveries of histamine in spiked samples at different derivative reaction times

由表2可知，當(dāng)衍生反應(yīng)時(shí)間大于40 min時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的回收率較高并趨于穩(wěn)定；而當(dāng)衍生時(shí)間小于40 min時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的回收率較低。說明適當(dāng)延長衍生反應(yīng)時(shí)間有利于衍生反應(yīng)完全，衍生效果較好?？紤]到時(shí)間成本，最終選擇衍生反應(yīng)時(shí)間為45 min。

2.3 色譜圖

在1.3 儀器工作條件下，分別測定質(zhì)量濃度為25.0 μg/mL 的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液和加標(biāo)樣品溶液，色譜圖如圖1～圖3 所示。由圖1～圖3可以看出，組胺衍生物色譜保留時(shí)間為19.299 min，內(nèi)標(biāo)1，7-二氨基庚烷的色譜保留時(shí)間為23.263 min，兩個(gè)色譜峰形尖銳、對稱、分離度良好。在空白樣品色譜圖中對應(yīng)保留時(shí)間位置未見組胺色譜峰，說明該方法專屬性好。

圖1 組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of histamine standard solution

圖2 空白樣品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample solution

圖3 加標(biāo)樣品溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of spiked sample solution

2.4 線性方程與檢出限

將質(zhì)量濃度為1.0～50.0 μg/mL 的組胺系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在1.3儀器工作條件下依次進(jìn)樣測定，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以不同組胺質(zhì)量濃度下對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，計(jì)算得到組胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=187.1x+44.516，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。表明該方法線性良好，能夠滿足實(shí)際樣品的測定要求。

選擇質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3儀器工作條件下進(jìn)行測定并記錄信號強(qiáng)度，以將信噪比S/N分別為3和10時(shí)對應(yīng)的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度換算為樣品中組胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，作為方法檢出限和定量限，得到該方法的檢出限為7.2 μg/kg，定量限為24 μg/kg。

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

在鲅魚樣品中分別添加2.5、10.0、25.0 μg/mL三種質(zhì)量濃度水平的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。按照1.4樣品處理方法衍生后進(jìn)行定量測定，結(jié)果列于表3。由表3 可知，樣品加標(biāo)平均回收率為96.8%～99.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.6%～3.7%(n=6)，表明該方法的準(zhǔn)確度、精密度較高，滿足實(shí)際樣品的測定要求。

表3 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Sample spiking recovery and precision test results

3 結(jié)語

建立了一種柱前衍生-高效液相色譜定量檢測魚類產(chǎn)品中組胺的方法。該方法衍生反應(yīng)步驟簡單、高效，能夠一步式完成衍生反應(yīng)和樣品處理過程，大幅節(jié)約樣品處理時(shí)間。實(shí)際樣品在不同添加水平下的回收率高(大于96%)，可用于魚類產(chǎn)品中組胺的定量檢測與質(zhì)量監(jiān)控。