田小容，劉嘉璽，占 婷，陳夢閣，田 霞，黃曉東

1. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科（武漢 430071）

2. 武漢市第三醫(yī)院（武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院）消化內(nèi)科（武漢 430060）

胃癌是一種常見的起源于胃上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，居全球癌癥死亡相關(guān)原因第三位，僅次于肺癌和結(jié)直腸癌[1]。由于胃癌早期癥狀缺乏特異性，確診主要依靠內(nèi)鏡檢查，因此大多數(shù)患者診斷為進(jìn)展期和晚期[2]。確定新的生物標(biāo)志物有助于進(jìn)一步提高對胃癌的理解，有助于開發(fā)新的靶向治療方法，以提高胃癌患者的生存率。SMRACAD1是SNF2 螺旋酶亞家族和含DEAD/H盒螺旋酶結(jié)構(gòu)域蛋白的ATP 酶SWI/SNF 家族成員，其參與DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、異染色質(zhì)建立和維持，以及DNA 損傷修復(fù)[3-4]。起初，人類Hel1 基因（現(xiàn)在被命名為SMRACAD1）被發(fā)現(xiàn)在e1a 表達(dá)細(xì)胞系中過表達(dá)，并通過基因組重排增加基因再激活的能力，這表明人類Hel1 基因可能在遺傳不穩(wěn)定發(fā)展中發(fā)揮作用，并將該基因定位到4q22-23 染色體上[5]。目前越來越多的研究表明，SMRACAD1與腫瘤細(xì)胞的增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和化療藥物敏感性有關(guān)，如肝細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌和惡性周圍神經(jīng)鞘腫瘤[6-10]，然而關(guān)于SMRACAD1在胃癌中的表達(dá)及其發(fā)病機(jī)制的報(bào)道較少。本研究旨在探討SMRACAD1對人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖 DMEM 培養(yǎng)基、F-12K 培養(yǎng)基、RIPA1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、凍存液均購自美國Gibco 公司；HiTrnace A、HiTrance B、shCON 和shSMRACAD1購自上海吉凱基因公司；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；EDU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海三箭生物公司；Trizol裂解液購自美國Invitrogen 公司；BCA 蛋白測定試劑盒和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；SAMARCAD1抗體、E-鈣黏蛋白抗體（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白抗體（E-cadherin）、波形蛋白抗體（Vimentin）、Snail 抗體、磷脂酰肌醇-3 激酶抗體（phosphatidylinosital-3 kinase，PI3K）、 蛋白激酶B 抗體（protein kinase B，AKT）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抗體（mamalian target of repamycin，mTOR）、磷酸化PI3K 抗體（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、 磷酸化AKT 抗體（phosphorylated AKT，p-AKT）、磷酸化mTOR抗體（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、β-actin 抗 體、GAPDH 抗 體HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher 公司；熒光定量PCR 儀、凝膠成像分析器、流式細(xì)胞分析儀購自美國Bio-Rad 公司；熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS 公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）組織和正常組織數(shù)據(jù)集來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/），TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集包括407 個組織，其中373 個胃癌組織、2 個癌旁組織、32 個正常組織。利用胃癌組織和正常組織數(shù)據(jù)分析SMRACAD1的差異表達(dá)。來自373 個胃癌組織的SMRACAD1數(shù)據(jù)用于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃黏膜細(xì)胞系GES-1 和人胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS 均購自中國科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)庫（中國上海），其中GES-1 細(xì)胞生長于高糖DMEM 培養(yǎng)基，HGC-27 細(xì)胞生長于RIPA1640 培養(yǎng)基，AGS 細(xì)胞生長于Ham's F-12K 培養(yǎng)基，置入37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。高糖DMEM 和Ham's F-12K培養(yǎng)基均加入10%的胎牛血清和1%的青-鏈霉素制成完全培養(yǎng)基。RIPA1640 培養(yǎng)基加入20%的胎牛血清和1%的青-鏈霉素制成完全培養(yǎng)基。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

從上海吉凱基因公司獲得表達(dá)SMRACAD1shRNA和陰性對照的慢病毒構(gòu)建體，shRNA序列如下：

SMRACAD1shRNA：

5’-CCAGCACCTGACAATTAA-3’

shCON：

5’-GCCTTATTTGACAATGCTTAT-3’

取對數(shù)生長期AGS 細(xì)胞進(jìn)行鋪板，待細(xì)胞密度達(dá)30%左右時，按照制造商說明使用HiTrance A轉(zhuǎn)染試劑將SMRACAD1shRNA 和shCON 分別轉(zhuǎn)移至六孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染72 h 后留取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR

取Trizol 裂解液從細(xì)胞中提取總RNA，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。PCR 在以下條件下進(jìn)行：95℃10 min，95℃15 s，60℃20 s，72℃40 s，40 個循環(huán)。計(jì)算Ct 值，以β-actin 為mRNA 的歸一化參考，采用2-△△Ct方法定量相對表達(dá)量。每個樣本檢測3 個，重復(fù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PCR 中使用的正向（F）和反向（R）引物序列如下：

SMRACAD1：

正向：5’-TCTTTGGCCCCTTTGTGTCC-3’

反向：5’-GAGAAGCTCCCTGTGCTACC-3’

β-actin:

正向：5’-CCTTCCTGGGCATGGAGTC-3’

反向：5’-TGATCTTCATTGTGCTGGGTG-3’

1.2.5 蛋白印跡法

取RIPA 裂解液裂解細(xì)胞后，用BCA 蛋白檢測試劑盒對細(xì)胞裂解液中的蛋白含量進(jìn)行定量。將蛋白加入SDS-PAGE 分離過程中，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉膜，用特異性單克隆一、二抗檢測SAMARCAD1、E-catenin、N-catenin、波形蛋白（Vimentin）、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mMOR、β-actin 和GAPDH 蛋白。

1.2.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)

取胰酶消化各組細(xì)胞后，用完全培養(yǎng)基將離心后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以500 個細(xì)胞/孔平鋪至6 孔板中，靜置培養(yǎng)12 天肉眼可見克隆的細(xì)胞團(tuán)塊，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)

取胰酶消化各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，每孔取100 μL，含4 000 個懸浮細(xì)胞，平鋪至96 孔板中，分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第2、3、4、5 天時每孔加入10 μL CCK-8 溶液，避光培養(yǎng)2 h 后用酶標(biāo)儀參數(shù)為450 nm 的光密度（optical density，OD）值測量細(xì)胞的增殖情況。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞6 孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用200 μL 槍頭豎直劃痕，PBS 清洗后完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，拍照后放入培養(yǎng)箱，待12 h、24 h 后再次拍照。

1.2.9 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

取各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)2 天后，胰酶消化各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，取200 μL 含5×104個懸浮細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，在涂有Matrigel 基質(zhì)膠（侵襲）或不涂有（遷移）Transwell 上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24～48 h 后4%聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS 清洗后顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，插圖數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比（n，%）描述，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMRACAD1在胃癌中表達(dá)上調(diào)

分析TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)SMRACAD1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)（P＜0.001），見圖1-A。此外，PCR 結(jié)果顯示，與GES-1 細(xì)胞相比，HGC-27 細(xì)胞（P＜0.01）和AGS 細(xì)胞（P＜0.001）中SMRACAD1表達(dá)顯著增高（圖1-B）。蛋白印跡法（Western blot，WB）結(jié)果與實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）結(jié)果一致，表明SMRACAD1的117kDa 的蛋白帶在HGC-27細(xì)胞和AGS 細(xì)胞中有差異，見圖1-C。

圖1 SMRACAD1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1. Expression of SMRACAD1 in gastric cancer tissues and cell lines

2.2 SMRACAD1下調(diào)抑制胃癌細(xì)胞的增殖

使用特異性靶向SMRACAD1的慢病毒載體處理AGS 細(xì)胞后，PCR 結(jié)果提示AGS 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shSMRACAD1后下調(diào)了SMRACAD1的表達(dá)（P＜0.001），見圖2-A。SMRACAD1表達(dá)下調(diào)后行CCK-8 檢測和平板克隆實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與shCON 組相比，shSMRACAD1組的AGS 細(xì)胞增殖速度在第2 天開始減弱，在第3 天增殖速度明顯減慢（P＜0.001），并且顯著抑制了AGS 細(xì)胞的克隆形成數(shù)，見圖2-B、圖2-C。

圖2 下調(diào)SMRACAD1后AGS細(xì)胞的增殖活性Figure 2. The proliferation activity of AGS cells after downregulating SMRACAD1

2.3 SMRACAD1下調(diào)抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shCON 組相比，shSMRACAD1組AGS 細(xì)胞在12 h、24 h 內(nèi)劃痕愈合速度明顯降低（P＜0.05），見圖3-A。此外，Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shCON 組相比，shSMRACAD1降低了AGS 細(xì)胞的遷移數(shù)量（P＜0.01）和侵襲數(shù)量（P＜0.001），見圖3-B、圖3-C。

圖3 下調(diào)SMRACAD1后AGS細(xì)胞的遷移和侵襲能力Figure 3. The migration and invasion ability of AGS cells after downregulating SMRACAD1

2.4 SMRACAD1下調(diào)抑制胃癌細(xì)胞EMT和PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活

KEGG 富集分析結(jié)果顯示，SMRACAD1主要參與中間絲組織、依賴于中間絲的細(xì)胞過程、中間絲的細(xì)胞骨架組織和角質(zhì)化（圖4-A）。SMRACAD1表達(dá)下調(diào)后AGS 細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin 和Snail 表達(dá)下調(diào)（圖4-B）。此外，與對照組相比，shSMRACAD1組AGS細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)無明顯差異，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 表達(dá)下調(diào)（圖4-C）。

3 討論

近年來，隨著衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的提高、幽門螺桿菌的根除和早期胃癌的篩查等，胃癌發(fā)病率從全球癌癥發(fā)病率第五位下降至第七位，但中國仍然是全球胃癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)[1,11-12]。盡管胃癌診斷及治療取得了顯著進(jìn)展，但由于術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，胃癌患者五年生存率在30%～35%[13]。探究胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)對胃癌的診斷和預(yù)后具有重要意義。

SMRACAD1是解旋酶超家族的染色質(zhì)重塑ATP酶，在維持染色質(zhì)穩(wěn)定性方面起重要作用，特別是在DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks, DSBs）修復(fù)中[14]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)SMRACAD1與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Al Kubaisy 等發(fā)現(xiàn)SMRACAD1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，并減少細(xì)胞間黏附能力[9]。Arafat 等發(fā)現(xiàn)SMRACAD1在乳腺癌組織中表達(dá)升高，下調(diào)SMRACAD1表達(dá)可通過下調(diào)IKK-β 表達(dá)和減少STAT3 磷酸化減少乳腺癌細(xì)胞增殖、集落形成和腫瘤生長，可成為乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)[15]。Liu 等發(fā)現(xiàn)SMRACAD1在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，是胰腺癌預(yù)后的不利因素，且下調(diào)SMARCDA1表達(dá)后可通過抑制Wnt/ β-catenin 信號通路抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT[8]。本研究對TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因分析發(fā)現(xiàn)SMRACAD1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SMRACAD1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。此外，下調(diào)SMRACAD1表達(dá)后AGS 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力降低。

EMT 在腫瘤進(jìn)展和遷移中起著重要作用，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得更高侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟[16]。許多信號通路參與EMT 的調(diào)控，其中PI3K/AKT/mTOR 信號通路與EMT 密切相關(guān)[17]。PI3K/AKT/mTOR 信號通路通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、EMT 和化療耐性藥性等多種機(jī)制參與胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[18]。KEGG 通路富集分析表明，SMARCDA1主要富集在與中間絲有關(guān)的信號通路。Vimentin 是蛋白質(zhì)中間絲家族的主要成分，也是EMT 的關(guān)鍵生物標(biāo)志物之一，有研究認(rèn)為Vimentin 可作為癌癥治療的潛在分子靶點(diǎn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)SMRACAD1表達(dá)后E-catenin 表達(dá)升高，E-catenin、Vementin 和Snail 表達(dá)降低，這表明SMARCDA1通過誘導(dǎo)EMT 促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn)下調(diào)SMRACAD1表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的表達(dá)，因此，SMRACAD1可能通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT。

綜上所述，SMRACAD1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)SMRACAD1的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的EMT和PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化，SMRACAD1可能通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和EMT 過程。