周佳林,段婧婧,王 寧,李 明,陳小鋒,薛利紅 〔.揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 5009;.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地),江蘇 南京 004〕

城市化導(dǎo)致湖泊氮、磷富集,造成湖泊水體富營(yíng)養(yǎng)化,且富營(yíng)養(yǎng)化水體會(huì)危害人體健康和破壞生態(tài)環(huán)境。生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的2022年《第二季度和1—6月全國(guó)地表水環(huán)境質(zhì)量狀況》中指出,在194個(gè)監(jiān)測(cè)湖泊中,中度富營(yíng)養(yǎng)12個(gè),占6.2%;輕度富營(yíng)養(yǎng)37個(gè),占19.1%;其余湖(庫(kù))為中營(yíng)養(yǎng)或貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[1]。因此,現(xiàn)階段針對(duì)中度富營(yíng)養(yǎng)及以下程度富營(yíng)養(yǎng)水體的修復(fù)十分重要。

生態(tài)浮床主要用于富營(yíng)養(yǎng)化水體的原位修復(fù),因其具有成本低廉、應(yīng)用廣泛和便于管理維護(hù)的特點(diǎn)而備受歡迎[2]。生態(tài)浮床的主要機(jī)理是運(yùn)用植株生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收作用以及植株根系富集的微生物代謝作用,達(dá)到去除水體中污染物質(zhì)的目的。植株選擇對(duì)生態(tài)浮床系統(tǒng)的凈化效果至關(guān)重要[3]。傳統(tǒng)的浮床植物常選用水生植株[4]。陸生植株根系發(fā)達(dá),較水生植株更耐污,且化感作用更強(qiáng),能夠抑制藻類生長(zhǎng)[5-6]。WANG等[7]提出陸生植物也可以作為浮床植物的觀點(diǎn)。研究[8-9]表明,陸生植株在人工濕地系統(tǒng)中能夠正常生長(zhǎng),且對(duì)氮、磷物質(zhì)具有較好的去除效果。因此,應(yīng)用陸生植株作為浮床植物凈化水質(zhì),有很好的發(fā)展前景。

微生物群落可反映水生態(tài)系統(tǒng)化學(xué)循環(huán)過(guò)程,并與水體水質(zhì)情況具有一定聯(lián)系[10]。16S rDNA高通量測(cè)序和定量 PCR(qPCR)相結(jié)合的技術(shù)是較為常用的水體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能基因的測(cè)試手段[11]。本地生長(zhǎng)的蔬菜、花卉對(duì)周邊環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng),不存在物種入侵風(fēng)險(xiǎn),且兼具經(jīng)濟(jì)效益和景觀性。同時(shí),陸生蔬菜具有豐富的根系微生物群落,但在水環(huán)境中培育時(shí),陸生蔬菜對(duì)水體環(huán)境的適應(yīng)性和根系表面微生物的影響尚不清楚。因此,根據(jù)地域特點(diǎn),挑選江浙一帶較為常見(jiàn)、易于水培的陸生蔬菜青菜和生菜,利用高通量及功能基因結(jié)合手段,探究陸生蔬菜浮床體系對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體氮、磷凈化效果以及對(duì)根系微生物群落結(jié)構(gòu)和反硝化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)采用160 L水箱(上部770 mm×560 mm,底部630 mm×430 mm,高460 mm)和管徑為10 mm的PVC管(35 mm×45 mm)定制浮床框架,在其上鋪漁網(wǎng),加定植籃筐(25 mm×31 mm×45 mm)12個(gè)作為浮床植株的載體。試驗(yàn)裝置見(jiàn)圖1。

圖1 試驗(yàn)裝置Fig.1 Experimental installation diagram

試驗(yàn)水體來(lái)源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水塘,初始水質(zhì)指標(biāo):ρ(TN)為5.1 mg·L-1,ρ(TP)為0.1 mg·L-1,ρ(NH4+)為0.2 mg·L-1,ρ(NO3-)為2.3 mg·L-1,pH為9.03,ρ(DO)為16.3 mg·L-1,電導(dǎo)率(SPC)為362.8 μS·cm-1,用純水稀釋3倍將水體ρ(TN)和ρ(TP)調(diào)節(jié)至約1.5和0.05 mg·L-1。從市場(chǎng)購(gòu)買江浙一帶具有耐寒性的常見(jiàn)蔬菜青菜、水芹和生菜用于開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前洗凈根部蔬菜,在試驗(yàn)水體(120 L)中預(yù)培養(yǎng)14 d,待穩(wěn)定后,正式開(kāi)始植株試驗(yàn)。正式試驗(yàn)于2022年4月20至5月3日進(jìn)行。設(shè)3個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)分為2個(gè)階段,試驗(yàn)第1～6天為第1階段,第7～13天為第2階段。試驗(yàn)期間,分別于試驗(yàn)1、3、5、7、9、11和13 d時(shí)取樣,每次取樣前補(bǔ)充一定量的純凈水至初始刻度,防止蒸發(fā)造成的影響。從3 d時(shí)開(kāi)始,每2 d補(bǔ)充一次營(yíng)養(yǎng)鹽,TN和TP補(bǔ)充量分別為0.2和0.012 mg·L-1。

1.2.1植株樣本的采集

試驗(yàn)前后稱量植株鮮重,且試驗(yàn)前每個(gè)處理另取與之相同鮮重的植株,用于得到試驗(yàn)前干重和體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)背景值。將烘干的植株樣磨碎、過(guò)篩,并于105 ℃條件下殺青30 min,于60 ℃烘箱烘干至恒重。稱取干重為0.1～0.2 g植株用于體內(nèi)全氮、全磷的測(cè)定。試驗(yàn)后測(cè)量根系長(zhǎng)度。

1.2.2水樣的采集

采用五點(diǎn)法取100 mL水樣用于營(yíng)養(yǎng)鹽的測(cè)定。

1.2.3根系水體及根系微生物的采集

用無(wú)菌針頭于試驗(yàn)1(前期)、7(中期)和13 d(后期)時(shí)抽取根系附近水體90 mL,用無(wú)菌0.22 μm孔徑濾膜抽濾后,放入2 mL無(wú)菌離心管中,存于-80 ℃冰箱中。試驗(yàn)結(jié)束后用無(wú)菌剪刀取植株根系5 g(鮮重),將無(wú)菌水沖洗后的根系置于裝有0.1 mol·L-1PBS緩沖液的50 mL無(wú)菌離心管中,超聲洗滌10 min,再用0.22 μm濾膜抽濾、保存,用于微生物反硝化功能基因和細(xì)菌群落多樣性的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1植株氮、磷的測(cè)定

植株體內(nèi)總氮濃度經(jīng)H2SO4-H2O2消煮,采用凱氏定氮儀測(cè)定?？偭诐舛冉?jīng)H2SO4-H2O2消煮,采用電感耦合等離子光譜發(fā)射儀(ICP)測(cè)定。

1.3.2水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

pH、水溫、溶解氧(DO)濃度、電導(dǎo)率(SPC)等水質(zhì)指標(biāo)采用便攜式水質(zhì)檢測(cè)儀原位測(cè)定。水體總氮濃度采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636—2012《水質(zhì) 總氮的測(cè)定 堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法》)測(cè)定,總磷濃度采用鉬酸銨分光光度法(GB/T 11893—1989《水質(zhì) 總磷的測(cè)定 鉬酸銨分光光度法》)測(cè)定,氨態(tài)氮濃度采用紫外分光光度法測(cè)定,硝態(tài)氮濃度采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定。

1.3.3DNA提取與PCR擴(kuò)增

微生物基因委托北京奧維森基因科技有限公司測(cè)定。測(cè)定方法:使用超純總DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,對(duì)微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物為ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和GGACTACHVGGGTWTCTAAT,擴(kuò)增區(qū)間為V3～V4區(qū)。nirK、nirS、nosZ和norB功能基因Real Time PCR檢測(cè)引物為nirK(FlaCu-R3Cua):上游引物為ATCATGGTSCTGCCGCG,下游引物為GCCTCGATCAGRTTGTGGTT;nirS(cd3a-R3cd):上游引物為GTSAACGTSAAGGARACSGG,下游引物為GASTTCGGRTGSGTCTTGA;nosZ:上游引物為CGYTGTTCMTCGACAGCCAG,下游引物為CGSACCTTSTTGCCSTYGCG;norB:上游引物為GGNCAYCARGGNTAYGA,下游引物為ACCCANAGRTGNACNACCCACCA。

PCR擴(kuò)增條件為94 ℃(5 min)預(yù)變性后,94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。將合格PCR產(chǎn)物按照樣本測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合,采用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.4 指標(biāo)計(jì)算

(1)植株相對(duì)生長(zhǎng)速率(RGR)的計(jì)算

(1)

式(1)中,Wt為t時(shí)間植株干重,g;Wt+1為t+1時(shí)間植株干重,g;t為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間,d;RRG為植株相對(duì)生長(zhǎng)速率,g·g-1·d-1;

(2)N、P污染負(fù)荷去除率的計(jì)算

(2)

式(2)中,C0為N或P營(yíng)養(yǎng)鹽添加濃度,mg·L-1;Ci為N或P初始濃度,mg·L-1;Cj為N或P最終濃度,mg·L-1;n為N或P營(yíng)養(yǎng)鹽添加次數(shù);V0為初始水體體積,L;V為添加營(yíng)養(yǎng)鹽后水體體積,L;w為N或P污染負(fù)荷去除率,%;

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0進(jìn)行描述和方差分析,采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),采用Origin 2021制圖;功能基因和環(huán)境因子相關(guān)性分析采用皮爾遜相關(guān)性分析(P<0.05,P<0.01)。MiSeq測(cè)序得到的PE reads序列首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾序列質(zhì)量,區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析,基于OTU聚類分析結(jié)果,計(jì)算α多樣性〔Chao1、覆蓋率(observed_species)、Shannon、Simpson〕。α多樣性、β多樣性和偏最小二乘辨別分析(PLS-DA)聚類計(jì)算均使用QIIME流程,采用R語(yǔ)言繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株生物量和根系變化

3種植株試驗(yàn)前后生物量變化情況見(jiàn)表1,其中,青菜生物量增加量最大,平均增重57.477 g;水芹次之,平均增重55.500 g;生菜增加量最小,平均增重14.743 g。試驗(yàn)后水芹處理組鮮重與生菜處理組呈顯著差異(P<0.05)。植株相對(duì)生長(zhǎng)速率由高到低依次為青菜、水芹和生菜,并呈顯著差異(P<0.05)。而收獲時(shí)水芹根系長(zhǎng)度顯著高于青菜和生菜(P<0.05)。

表1 植株物理指標(biāo)Table 1 Physical indicators of plants

由表2可知,與試驗(yàn)前相比,試驗(yàn)后青菜體內(nèi)全氮、全磷含量顯著下降(P<0.05),水芹和生菜體內(nèi)全氮含量顯著下降(P<0.05),試驗(yàn)后各處理間無(wú)顯著差異。由表3可知,青菜和生菜處理氮凈去除量(75.720～81.460 mg)高于對(duì)照和水芹處理(47.360～50.320 mg),青菜處理組植株吸氮量高于水芹處理組,生菜處理組其他吸氮量最大。

表2 植株體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素濃度Table 2 Concentration of nutrients in the plants

表3 各處理氮平衡分析Table 3 Analysis of nitrogen balance in the treatments

2.2 水體水質(zhì)氮磷濃度變化及去除率

如圖2所示,水體溫度維持在16～27 ℃,以第9天為分界點(diǎn)呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。水體pH維持在9～11,并呈上升趨勢(shì),前9天對(duì)照組最高。DO濃度和SPC變化趨勢(shì)相同,均以第5天為分界點(diǎn)呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。前7天水芹和青菜處理組DO濃度低于生菜和對(duì)照組,后期生菜DO濃度較其他處理組低。生菜處理組SPC一直較低,后期各處理組SPC由高到低依次為水芹、青菜、對(duì)照和生菜。

DO為溶解氧,SPC為電導(dǎo)率。圖2 水質(zhì)物理指標(biāo)Fig.2 Physical indicators of water quality

2.2.1水體氮磷濃度變化及去除率

水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度變化分為2個(gè)階段(圖3)。如圖3(a)所示,蔬菜浮床經(jīng)第1階段培養(yǎng)后,除水芹處理組外,青菜和生菜處理組TN濃度明顯下降,蔬菜處理組TN濃度均低于對(duì)照組。進(jìn)入第2階段后,蔬菜處理組和對(duì)照組TN濃度有所累積,且對(duì)照組TN高于蔬菜處理。如圖4(a)所示,在組內(nèi)水平上,各組試驗(yàn)第1階段TN污染負(fù)荷去除率與第2階段無(wú)明顯差異。而在組間水平上,第1階段水芹處理組TN污染負(fù)荷去除率與生菜處理組間差異顯著(P<0.05)。2個(gè)階段TN平均負(fù)荷去除率從高到低依次為生菜(33.93%)、青菜(31.20%)、對(duì)照(24.41%)和水芹(9.05%)。

如圖3(b)所示,經(jīng)第1階段培養(yǎng)后,蔬菜處理組水體TP濃度下降,而對(duì)照組出現(xiàn)TP累積現(xiàn)象,導(dǎo)致對(duì)照組TP濃度高于其他處理組。進(jìn)入第2階段后,陸生蔬菜處理組TP濃度于試驗(yàn)11 d時(shí)急劇累積,之后快速下降,其中,只有青菜處理組TP濃度高于對(duì)照組。如圖4(b)所示,第1階段處理組TP污染負(fù)荷去除率與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05),且隨著試驗(yàn)的進(jìn)行,青菜和水芹處理組TP污染負(fù)荷去除率下降,生菜處理組去除率相對(duì)穩(wěn)定,而對(duì)照組去除率上升。結(jié)合第1和第2階段結(jié)果,水芹、生菜和青菜處理組TP負(fù)荷平均去除率(57.13%、46.91%和40.86%)優(yōu)于對(duì)照組(25.46%)。

如圖3(c)所示,經(jīng)第1階段培養(yǎng)后,蔬菜處理組NO3-濃度有所累積,而對(duì)照組NO3-濃度降低,各處理組水體NO3-濃度由高到低依次為生菜、對(duì)照、水芹和青菜。進(jìn)入第2階段培養(yǎng)后,各處理組NO3-濃度呈累積趨勢(shì),最終對(duì)照組NO3-濃度最高,生菜處理組NO3-濃度最低。如圖4(c)所示,各處理組NO3-污染負(fù)荷去除率無(wú)明顯差異。2個(gè)階段NO3-負(fù)荷平均去除率由高到低依次為青菜(39.96%)、對(duì)照(39.71%)、生菜(31.19%)和水芹(30.99%)。

試驗(yàn)期間未添加任何形式的銨鹽。如圖3(d)所示,經(jīng)第1階段培養(yǎng)后,各處理組NH4+濃度明顯下降,對(duì)照組NH4+濃度略高。進(jìn)入第2階段培養(yǎng)后,青菜處理組NH4+濃度有所累積,這與其他處理組變化趨勢(shì)相反。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),水芹處理組NH4+濃度最低。如圖4(d)所示,第2階段青菜處理組NH4+污染負(fù)荷去除率(-36.02%)與其他處理組呈顯著差異(P<0.05)。2個(gè)階段水芹處理組(51.30%)和生菜處理組(48.16%)NH4+負(fù)荷平均去除率明顯高于對(duì)照組(27.23%)和青菜處理組(5.17%)。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)及基因豐富度分析

2.3.1微生物群落結(jié)構(gòu)

試驗(yàn)結(jié)果共提取23 360條有效序列,經(jīng)抽平處理獲得4 421個(gè)OTU。由表4可知,各處理組OTU數(shù)量在試驗(yàn)中期達(dá)到峰值,試驗(yàn)?zāi)┢贠TUs較初期高。

表4 各處理組OTUs數(shù)量Table 4 Details of OTUs in each process

由圖5可知,試驗(yàn)結(jié)果表明,屬水平上發(fā)現(xiàn)15種優(yōu)勢(shì)菌屬,包括黃桿菌屬(Flavobacterium)、棲湖菌屬(Limnohabitans)、產(chǎn)卟啉桿菌屬(Porphyrobacter)、Cyanobium_PCC-6307、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、多核桿菌屬(Polynucleobacter)、UKL13-1、嗜湖水橙色桿狀菌(Sandarakinorhabdus)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、Schrenkiella_parvula、玫瑰單胞菌(Roseomonas)、Pseudanabaena_PCC-7429、大不里士桿菌屬(Tabrizicola)和玫瑰球菌屬(Roseococcus)。

Bra為青菜處理,Oja為水芹處理,Lsa為生菜處理,Ctr為對(duì)照;1、7和13表示不同采集天數(shù)水樣;R表示第13天蔬菜根系。圖5 屬水平物種組成Fig.5 genus level species composition

黃桿菌屬相對(duì)豐度在蔬菜根系明顯低于蔬菜根系周圍水體(P<0.05)。在試驗(yàn)全程,青菜、水芹處理組黃桿菌屬相對(duì)豐度下降。試驗(yàn)結(jié)束后,蔬菜處理組黃桿菌屬相對(duì)豐度低于對(duì)照組。棲湖菌屬相對(duì)豐度以對(duì)照組為較大,在試驗(yàn)全程相對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì),其中,試驗(yàn)1和7 d時(shí)對(duì)照組棲湖菌屬相對(duì)豐度明顯高于其他處理組(P<0.05)。產(chǎn)卟啉桿菌屬和UKL13-1相對(duì)豐度在水芹根系周圍水體中明顯增加(P<0.05)。對(duì)照組多核桿菌屬、嗜湖水橙色桿狀菌相對(duì)豐度較高,且在試驗(yàn)?zāi)┢诿黠@高于其他(P<0.05)。

在試驗(yàn)后期青菜根系周圍水體及根系表面Cyanobium_PCC-6307相對(duì)豐度高于其他處理組(P<0.05)。芽單胞菌屬相對(duì)豐度在青菜根系周圍水體以及水芹和生菜根系表面最高(P<0.05)。各蔬菜根系紅桿菌屬相對(duì)豐度明顯高于根系周圍水體和對(duì)照組(P<0.05)。在試驗(yàn)全程,對(duì)照組噬氫菌屬相對(duì)豐度均明顯低于其他處理組(P<0.05),且以水芹、生菜根系為最高(P<0.05)。青菜和水芹根系玫瑰單胞菌和玫瑰球菌屬相對(duì)豐度明顯高于根系周圍水體(P<0.05)。生菜根系Pseudanabaena_PCC-7429相對(duì)豐度明顯高于其他處理組(P<0.05)。試驗(yàn)后期,大不里士桿菌屬相對(duì)豐度在青菜、水芹根系水體及根系表面明顯高于其他處理組(P<0.05)。

2.3.2微生物群落豐富度和物種多樣性

(1)α群落多樣性

由表5可知,試驗(yàn)過(guò)程中水芹處理組微生物群落豐富度最高,對(duì)照組微生物群落豐富度最低。試驗(yàn)過(guò)程中,微生物群落豐富度于7 d時(shí)達(dá)到峰值后下降,但在試驗(yàn)?zāi)┢诟魈幚斫M微生物群落豐富度較1 d時(shí)增加。各處理組蔬菜根系微生物群落豐富度由大到小依次為水芹、生菜和青菜。Shannon和Simpson指數(shù)用來(lái)估算樣本中微生物多樣性,Shannon和Simpson指數(shù)值越大,說(shuō)明群落多樣性越高。根據(jù)Shannon和Simpson指數(shù)可知,試驗(yàn)初期水芹處理組微生物多樣性最高,試驗(yàn)第7天生菜處理組物種多樣性最高,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)水芹處理組物種多樣性最高,對(duì)照組物種多樣性在試驗(yàn)全程均為最低。試驗(yàn)過(guò)程中,青菜處理組微生物多樣性持續(xù)升高,水芹處理組先減少后增加,生菜處理組和對(duì)照組先升高后降低。除對(duì)照組外,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蔬菜處理組微生物群落多樣性指數(shù)均比試驗(yàn)初期有所增加。各蔬菜根系微生物多樣性由大到小依次為水芹、生菜和青菜。

表5 α多樣性指數(shù)Table 5 Alpha diversity index

(2)β群落多樣性

各樣本間的距離表示樣本間的差異性,距離越近則越相似,距離越遠(yuǎn)則差異越大。由圖6(a)可知,各個(gè)根系處理組與各個(gè)水體處理組樣本距離遠(yuǎn),說(shuō)明根系和水體的組成有差異,其中水芹根系處理組和青菜根系處理組的距離近,其相似度高。對(duì)照中期、生菜中期、生菜末期、水芹前期和水芹末期樣本點(diǎn)分布分散,且離其他樣本點(diǎn)較遠(yuǎn)。

Bra為青菜處理,Oja為水芹處理,Lsa為生菜處理,Ctr為對(duì)照。1、7和13表示不同采集天數(shù)水樣;R表示第13天蔬菜根系。T為溫度,DO為溶解氧,SPC為電導(dǎo)率,TN為總氮,TP為總磷。圖6 β多樣性指標(biāo)偏最小二乘辨識(shí)分析(PLS-DA)和環(huán)境因子冗余分析(RDA)Fig.6 β diversity index PLS-DA and environmental factor analysis RDA

(3)微生物群落與環(huán)境因子影響因素分析

由圖6(b)可知,環(huán)境因子對(duì)微生物群落的解釋為68.7%。pH、NH4+和水溫(T)對(duì)微生物群落的影響較為明顯,黃桿菌屬和棲湖菌屬與NH4+、T、TN和DO呈現(xiàn)正相關(guān),紅桿菌屬和Cyanobium_PCC-6307與pH、SPC、TP和NO3-呈現(xiàn)正相關(guān)。

2.3.3微生物功能基因豐度與環(huán)境因子相關(guān)性分析

(1)功能基因豐度

各處理組根系及其周圍水體微生物功能基因(nirK、nirS、nosZ、和norB)拷貝數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7(a)可知,對(duì)照組水體中nirK基因拷貝數(shù)較其他處理組高,且7 d時(shí)對(duì)照組水體中和13 d時(shí)水芹根系nirK基因拷貝數(shù)顯著高于其他處理組(P<0.05)。由圖7(b)可知,試驗(yàn)后期青菜處理組水體中nirS基因拷貝數(shù)增加較多,青菜根系表面富集nirS基因拷貝數(shù)顯著低于其他處理組(P<0.05)。nosZ和norB基因拷貝數(shù)變化趨勢(shì)與nirS基因相同,均呈現(xiàn)13 d時(shí)基因拷貝數(shù)比1 d時(shí)增加的趨勢(shì)〔圖7(b)～(d)〕。

同一幅圖中,同一組柱子上方英文小寫(xiě)字母不同表示同一條件下不同處理間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤。1、7和13表示不同采集天數(shù)水樣,13-R表示第13天蔬菜根系。圖7 不同處理組根系及周圍水體基因豐度Fig.7 Abundance of functional genes in roots and surrounding water of different vegetable treatments

(2)功能基因與環(huán)境因子相關(guān)性分析

各功能基因與環(huán)境因子的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表6。nirK基因與TN、NO3-分別呈顯著正相關(guān)(P<0.05)和極顯著正相關(guān)(P<0.01);nirS、nosZ和norB基因僅與環(huán)境因子T呈顯著相關(guān)(P<0.05);nirS、nosZ和norB基因兩兩之間呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。

表6 反硝化功能基因與環(huán)境因子之間皮爾遜相關(guān)性Table 6 Pearson product-moment correlation coefficient between denitrification function genes and environmental factors

3 討論

3.1 環(huán)境參數(shù)與氮磷的變化

水質(zhì)參數(shù)是評(píng)判生態(tài)環(huán)境是否健康的重要特征指標(biāo)。試驗(yàn)水體初始pH呈堿性(圖2),水體中有藻類和浮游動(dòng)物存在,推測(cè)水中藻類的光合作用導(dǎo)致pH過(guò)高[12]。在試驗(yàn)前期,水體pH有所下降,這可能是由于在試驗(yàn)初期微生物硝化作用活躍,產(chǎn)生大量H+,使水體pH降低[13]。同時(shí),根據(jù)皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果(表6)可知,高pH可以降低水中NH4+濃度,這與化學(xué)平衡結(jié)果一致。水體DO濃度呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)(圖2),這是由于水體DO濃度與空氣中氧氣和藻類光合作用有關(guān),溫度驟降會(huì)導(dǎo)致DO濃度突然下降[14]。同時(shí),微生物迅速增長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致水體DO濃度下降。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行,水體微生物代謝水平相對(duì)穩(wěn)定,植株根系泌氧功能增強(qiáng),導(dǎo)致DO濃度回升[15]。

大量研究表明,N、P循環(huán)主要包括3個(gè)部分:外界環(huán)境、底泥釋放、大氣沉降和生物固氮等途徑的源過(guò)程;植物吸收、反硝化等途徑的去除過(guò)程;生物吸收和排泄、硝化作用、微生物分解等途徑的遷移和轉(zhuǎn)化過(guò)程[16-17]。蔬菜浮床對(duì)水體N凈化能力有差異,這是由于植株本身生理特性差異造成的。陸生蔬菜的青菜、生菜對(duì)TN的去除效果明顯好于水芹(P<0.05),造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于陸生蔬菜在水培時(shí),由于生存環(huán)境改變,陸生蔬菜急需大量營(yíng)養(yǎng)元素,而水芹作為濕生植物在水體中適宜性較強(qiáng)。所需營(yíng)養(yǎng)元素含量不同導(dǎo)致青菜和生菜對(duì)TN的去除效果較好。與此同時(shí),在低營(yíng)養(yǎng)水體環(huán)境中,植株為了維持自身生命體征,當(dāng)水中營(yíng)養(yǎng)鹽不能滿足代謝要求時(shí),植株消耗體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)鹽含量下降。

除此之外,植株根系泌氧是影響水體中氮去除的重要因素。根系泌氧功能主要通過(guò)改善脫氮微生物生存環(huán)境、影響脫氮微生物群落結(jié)構(gòu)與活性、維持硝化反應(yīng)所需的好氧環(huán)境等方式,從而起到促進(jìn)脫氮的效果[18]。此外,植物在生長(zhǎng)過(guò)程中,會(huì)分泌根系分泌物,為浮床系統(tǒng)提供內(nèi)在碳源[19]。鄧泓等[20]通過(guò)研究10種濕地植株根系泌氧特征,發(fā)現(xiàn)水芹根部任意部位均具有較高的泌氧速率,其根部存在發(fā)達(dá)的通氣組織。嵇慶才等[21]發(fā)現(xiàn)水稻在土培、水培中生物形態(tài)有所不同,土培會(huì)促進(jìn)葉片生長(zhǎng),而水培會(huì)促進(jìn)根系生長(zhǎng)。筆者研究結(jié)果表明,水芹根系茂盛、長(zhǎng)且粗大,青菜和生菜根系長(zhǎng)度相差不大,其中,生菜須根多,根表面積較大,這可能是生菜生物量較小但其根系微生物豐度較高的原因。這說(shuō)明陸生植株水培后會(huì)促進(jìn)其根部生長(zhǎng),根系泌氧功能在一定程度上會(huì)得到增強(qiáng),從而提高其脫氮能力。試驗(yàn)后期植株生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定,N、P吸收能力有所下降。對(duì)照組在試驗(yàn)前期對(duì)NH4+去除能力較好,這可能與藻類生長(zhǎng)和微生物代謝有關(guān)[22]。因此,陸生蔬菜的青菜、生菜通過(guò)植物吸收和改變微生物豐度作為氮素去除的主要方式,整體脫氮效果與水芹相當(dāng)。

3.2 蔬菜浮床對(duì)微生物物種多樣性的影響

筆者試驗(yàn)中黃桿菌屬(Flavobacterium)、棲湖菌屬(Limnohabitans)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、紅桿菌屬(Rhodobacter)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)等屬為優(yōu)勢(shì)物種,具有較高的豐度(>0.08%),且能夠參與氮轉(zhuǎn)化過(guò)程。

硝化作用是去除水中NH4+的重要途徑,研究發(fā)現(xiàn)棲湖菌屬在淡水系統(tǒng)廣泛分布,具有可以代謝多種底物的能力,部分菌種具有二氧化碳固定作用、光合作用和氨氧化等多種代謝功能[18]。對(duì)照組水體中棲湖菌屬相對(duì)豐度在試驗(yàn)前期較高,且其去除NH4+的效果較好;在試驗(yàn)開(kāi)展后其相對(duì)豐度明顯下降(P<0.05),水體NH4+的去除能力也明顯下降。這與劉明坤[23]發(fā)現(xiàn)NH4+與棲湖菌屬呈正相關(guān)的結(jié)論一致。在試驗(yàn)后期對(duì)照組水體NH4+濃度較高可能與硝酸鹽異化還原為氨有關(guān)[24]。而在試驗(yàn)初期和后期蔬菜浮床處理水體棲湖菌屬相對(duì)豐度較低,但對(duì)NH4+的去除效果較好,這說(shuō)明蔬菜浮床系統(tǒng)的脫氮方式較為多樣且可以抑制硝酸鹽異化還原為氨的過(guò)程。

研究[25-29]發(fā)現(xiàn),黃桿菌屬、紅桿菌屬和噬氫菌屬都屬于典型的反硝化菌屬,其中,黃桿菌屬具有厭氧硝化、好氧反硝化的作用。LIU等[30]在曝氣濾池中發(fā)現(xiàn)了氮氧化菌類的黃桿菌屬具有較高豐度。筆者試驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)照無(wú)蔬菜處理組黃桿菌屬相對(duì)豐度較高,對(duì)TN、NO3-的去除效果較好。同時(shí),各處理組水體中黃桿菌屬相對(duì)豐度較高。紅桿菌屬對(duì)氮、磷及有機(jī)物具有較好的去除效果[28],筆者試驗(yàn)結(jié)果表明其豐度在陸生蔬菜根系表面和水芹根系周圍水體中較高,且對(duì)NO3-的去除效果較好。這說(shuō)明蔬菜浮床可以利用水體中黃桿菌屬和蔬菜根系表面的紅桿菌屬進(jìn)行反硝化脫氮。

其次,在凈化低污染水體、富營(yíng)養(yǎng)化湖泊和人工濕地過(guò)程中,由于低C/N比對(duì)反硝化過(guò)程具有限制作用,水體會(huì)出現(xiàn)許多自養(yǎng)反硝化過(guò)程(硫自養(yǎng)反硝化、鐵自養(yǎng)反硝化和氫自養(yǎng)反硝化)[31]。其中,氫自養(yǎng)反硝化過(guò)程主要消耗H2和NO3-。GAO等[32]在低C/N比(C/N比為2∶1)條件下,通過(guò)電解強(qiáng)化手段將人工濕地中噬氫菌屬相對(duì)豐度從6.0%提升至24.3%。說(shuō)明富營(yíng)養(yǎng)化水體在缺少碳源條件下,水中H2可被用作電子供體,使噬氫菌屬以氫自養(yǎng)方式進(jìn)行反硝化。筆者試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),在水芹和生菜根系表面具有氫自養(yǎng)功能的噬氫菌屬相對(duì)豐度(分別為5.67%和5.73%)顯著高于其他菌屬(P<0.05)。此外,許多水體和土壤環(huán)境也均發(fā)現(xiàn)芽單胞菌屬的存在。ZHANG等[33]從芽單胞菌屬中檢測(cè)出與反硝化和碳固定相關(guān)的基因。芽單胞菌屬攜帶nosZ基因,可以通過(guò)反硝化作用減少N2O,將N2O轉(zhuǎn)化為N2[34]。筆者試驗(yàn)中芽單胞菌屬主要分布于水芹、生菜根系表面,通過(guò)反硝化作用將N2O轉(zhuǎn)化為N2。筆者試驗(yàn)結(jié)果表明生菜根系微生物豐富,這說(shuō)明生菜浮床不僅能夠通過(guò)顯著增加氫自養(yǎng)反硝化的方式來(lái)脫氮,還可以實(shí)現(xiàn)完全反硝化以減少溫室氣體的產(chǎn)生。

3.3 浮床蔬菜對(duì)反硝化微生物的影響

水體中反硝化作用主要是NO3-經(jīng)硝酸鹽還原酶(nitrate reductase,Nar)催化為NO2-,其次經(jīng)亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase,Nir)催化成NO,再次經(jīng)氧化氮還原酶(nitric oxide reductase,Nor)催化成N2O,最后經(jīng)氧化亞氮還原酶(nitrous oxide reductase,Nos)催化成N2的過(guò)程[35]。nirK基因的催化過(guò)程是將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氧化氮,這是反硝化作用有別于其他硝酸鹽代謝的標(biāo)志性反應(yīng),該基因編碼的亞硝酸鹽還原酶是催化該反應(yīng)的限速酶,nirK和nirS基因編碼催化產(chǎn)物是NO和N2O混合物[36]。

筆者研究結(jié)果表明,各處理組nirK基因拷貝數(shù)是nirS基因的10倍以上,這是由于nirK基因更多存在于細(xì)菌中,且兩者不能共存[37]。對(duì)照組nirK基因處于優(yōu)勢(shì),這對(duì)硝酸鹽降解起到一定作用,這與對(duì)照組NO3-的去除結(jié)果保持一致。其次,在試驗(yàn)后期,水芹和生菜根系表面nirK基因豐度遠(yuǎn)高于各自周圍水體。這表明水芹、生菜根系表面會(huì)聚集nirK基因,使反硝化微生物大量繁殖,以此來(lái)增強(qiáng)對(duì)NO3-的去除。筆者試驗(yàn)結(jié)果還顯示,水芹和生菜根系表面nirS和norB基因豐度較高,而青菜根系周圍水體中這兩個(gè)基因豐度較高,這說(shuō)明不同于水芹和生菜浮床系統(tǒng),青菜浮床系統(tǒng)主要依賴于水體中具有反硝化功能的基因來(lái)促進(jìn)反硝化過(guò)程。

nosZ基因可以將N2O催化成N2后排放出去,這是減少溫室氣體排放的關(guān)鍵步驟。而在某些含有nir和nor基因的細(xì)菌和古菌中,往往缺失nos基因,使得反硝化過(guò)程終產(chǎn)物為N2O[34]。此外,研究[38]發(fā)現(xiàn),nirS型反硝化菌往往攜帶nosZ基因(CupriaviduseutrophaJMP134除外),這可能是nosZ與nirS基因變化趨勢(shì)相同但其相對(duì)豐度較小的原因。筆者試驗(yàn)中,在青菜根系周圍水體以及水芹和生菜根系表面都發(fā)現(xiàn)較高相對(duì)豐度的nosZ基因,這說(shuō)明蔬菜浮床系統(tǒng)有利于進(jìn)行完整的反硝化過(guò)程,從而有效減少水體中溫室氣體的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

(1)蔬菜浮床系統(tǒng)中水芹生物量最大,植物根系發(fā)育最好,而青菜生長(zhǎng)速率顯著較高,且具有較好的氮磷去除潛力。但是,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)3種蔬菜體內(nèi)全氮、全磷含量均有所下降。

(2)在富營(yíng)養(yǎng)化水體環(huán)境中,蔬菜浮床系統(tǒng)對(duì)TN、TP和NH4+去除效果較好,這可能與根系表面或周圍水體中富集的優(yōu)勢(shì)菌種分布有關(guān)。

(3)分布于水芹、生菜根系表面的噬氫菌屬會(huì)通過(guò)增加氫自養(yǎng)反硝化的方式增強(qiáng)反硝化作用,其表面富集的芽單胞菌屬能將N2O轉(zhuǎn)化為N2以減少溫室氣體排放。

(4)蔬菜浮床系統(tǒng)中nirS、norB和nosZ基因相對(duì)較多,這表明蔬菜浮床系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)更徹底的反硝化。