張勇 張洪蘭 秦晗

[摘要]?目的?探討Periostin在替牙期對骨改建和自噬的影響，研究Periostin在乳恒牙替換過程中調(diào)節(jié)骨代謝平衡的作用機(jī)制。方法?收集筆者所在醫(yī)院因乳牙根尖周病及多生牙拔除的牙根周圍粘連牙槽骨，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組各15例，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加Periostin，原位雜交法檢測標(biāo)本中Periostin、骨代謝基因、自噬基因的mRNA水平。蛋白質(zhì)印記法檢測成骨細(xì)胞中骨代謝蛋白，自噬蛋白表達(dá)。結(jié)果?原位雜交結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Periostin表達(dá)低于對照組（P<0.05），核因子κB受體活化因子配體（receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand，RANKL）、LC3、BECN1表達(dá)及RANKL/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）值高于對照組（均P<0.05），OPG表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；蛋白質(zhì)印跡法顯示實(shí)驗(yàn)組RANKL、RANKL/OPG、LC3Ⅱ、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與對照組比較水平低（均P<0.05），OPG、LC3Ⅰ較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。結(jié)論?Periostin通過降低RANKL表達(dá)及改善過強(qiáng)自噬狀態(tài)，從而減少炎癥所致的骨吸收。

[關(guān)鍵詞]?骨膜蛋白；骨改建；乳恒牙替換；自噬

[中圖分類號]?R788????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.02.001

Clinical?significance?of?Periostin?expression?in?the?replacement?of?primary?permanent?teeth

ZHANG?Yong1，?ZHANG?Honglan2，?QIN?Han1

1.Department?of?Stomatology，?Lianyungang?Clinical?Medical?College?Nanjing?Medical?University，?Lianyungang?222000，?Jiangsu，?China;?2.Department?of?Pathology，?Lianyungang?Clinical?Medical?College?Nanjing?Medical?University，?Lianyungang?222000，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?periostin?on?bone?remodeling?and?autophagy?during?the?period?of?tooth?replacement?and?to?investigate?the?mechanism?of?action?of?periostin?in?regulating?the?balance?of?bone?metabolism?during?the?replacement?of?primary?and?permanent?teeth.?Methods?Fifteen?cases?each?of?experimental?and?control?groups?were?collected?from?the?periapical?periodontal?disease?and?multiple?teeth?extracted?for?periapical?adhesions?in?the?author’s?hospital，?the?mRNA?levels?of?periostin，?bone?metabolism?genes，?and?autophagy?genes?were?detected?in?the?specimens?by?in?situ?hybridization.?Osteoblasts?were?cultured?in?vitro，?periostin?was?added?to?the?culture?medium?of?the?experimental?group，?and?the?expression?of?bone?metabolism?proteins?[receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand?（RANKL），?osteoprotegerin?（OPG）]?and?autophagy?proteins?（LC3，?Beclin-1）?in?osteoblasts?was?detected?by?Western?blot.?Results?In?situ?hybridization?results?showed?that?periostin?expression?in?the?experimental?group?was?lower?than?that?in?the?control?group?（P<0.05），?RANKL，?LC3，?BECN1?expression?and?RANKL/OPG?values?were?higher?than?those?in?the?control?group?（all?P<0.05），?and?no?significant?differences?were?seen?in?OPG?expression?（P>0.05）;?protein?blotting?showed?that?RANKL，?RANKL/OPG，?LC3Ⅱ，?Beclin-1，?LC3Ⅱ/LC3Ⅰ?were?lower?in?the?experimental?group?than?in?the?control?group?（all?P<0.05），?and?no?significant?differences?were?seen?in?OPG?and?LC3Ⅰ?than?in?the?control?group?（P>0.05）.?Conclusion?Periostin?reduces?inflammation-induced?bone?resorption?by?reducing?RANKL?expression?and?improving?hyperautophagic?state.

[Key?words]?Periostin;?Bone?remodeling;?Tooth?replacement;?Autophagy

骨膜蛋白（Periostin）是一種細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular?matrix，ECM）蛋白，最初即是發(fā)現(xiàn)于成骨細(xì)胞當(dāng)中，在骨重塑的過程中，Periostin表達(dá)水平升高并具有維持正常骨改建的作用[1-2]。乳恒牙替換是骨改建十分活躍的生理活動，乳牙根尖周炎會導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng)，骨形成減弱[3]。由成骨細(xì)胞等細(xì)胞分泌產(chǎn)生的核因子κB受體活化因子配體（receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand，RANKL）能夠與核因子κB受體活化因子（receptor?activator?of?nuclear?factor-κB?ligand，RANK）結(jié)合激活破骨細(xì)胞，骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）和RANK競爭與RANKL結(jié)合減弱破骨細(xì)胞活性，因此RANKL、OPG的相對水平可以反應(yīng)骨吸收的活躍程度，即RANKL/OPG比值高時(shí)，骨吸收活躍，反之，則骨吸收受抑制[4-7]。乳恒牙替換異常的一項(xiàng)重要原因是根尖周炎癥導(dǎo)致的過強(qiáng)骨吸收[8]。

炎癥與自噬之間關(guān)系密切，自噬被視為機(jī)體的一種防御功能，它具有清除受損細(xì)胞器和感染病原體的能力，同時(shí)自噬能夠修飾病原體，使其病原體能夠穩(wěn)定的存在于宿主體內(nèi)，這表明自噬與炎癥之間存在雙向調(diào)節(jié)作用，維持組織平衡[9-12]。Izuhara等[13]研究結(jié)果表明，感染性炎癥加重時(shí)，Periostin表達(dá)水平降低。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule?associated?protein?1?light?chain，LC3）和Beclin-1是被廣為認(rèn)可的自噬標(biāo)志物，其中LC3基因編碼的蛋白隨自噬活動變化分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，其中LC3Ⅱ/LCI的比值反映了自噬強(qiáng)度，該值越高，自噬越強(qiáng)，反之，自噬越弱，Beclin-1是由BECN1基因編碼的蛋白質(zhì)，上調(diào)Beclin-1會增強(qiáng)自噬水平[14-18]。本研究通過檢測臨床標(biāo)本和細(xì)胞中不同Periostin水平下骨代謝和自噬強(qiáng)度的影響，初步探討Periostin在乳恒牙替換過程中調(diào)節(jié)骨代謝平衡的機(jī)制。

1??材料與方法

1.1??主要材料

牙槽骨標(biāo)本（南京醫(yī)科大學(xué)連云港臨床醫(yī)學(xué)院）、原位雜交試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）、DAB染色劑（北京中杉金橋生物科技有限公司）、小鼠成骨細(xì)胞系（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）、胎牛血清（上海威正翔生物科技有限公司）、BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）、蛋白質(zhì)預(yù)染標(biāo)志物（上海賽默飛世爾有限公司）、ECL-PLUS試劑盒（上海賽默飛世爾有限公司）、SDS-PAGE蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司）、蛋白轉(zhuǎn)能儀（上海天能科技有限公司）、離心機(jī)（上海賽默飛世爾有限公司）、倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）、生物安全柜（上海振祥創(chuàng)科技有限公司）、CO2培養(yǎng)箱（日本三洋貿(mào)易株式會社）。本研究經(jīng)過連云港市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（倫理審批號KY-20220224003）。

1.2??原位雜交臨床標(biāo)本

收集所在醫(yī)院2021年9月至2022年6月重度乳牙根尖周病拔除的滯留乳牙為標(biāo)本，甲酸脫鈣4周，制備成組織切片，使用多聚賴氨酸處理過的載玻片，脫蠟至水，30%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，胃蛋白酶暴露核酸片段，4%多聚甲醛后固定標(biāo)本，按原位雜交試劑盒進(jìn)行組織化學(xué)染色，依次進(jìn)行與預(yù)雜交、雜交，分別加入封閉液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶，DAB鏡下控制染色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察Periostin、核因子κB受體活化因子配體（receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand，RANKL）、骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、BECN1、LC3的mRNA表達(dá)，使用Image?J量化分析表達(dá)。

1.3??成骨細(xì)胞培養(yǎng)與分組

取出購置的成骨細(xì)胞系，在37℃?5%CO2的培養(yǎng)箱中分實(shí)驗(yàn)組（n=15，a-MEM培養(yǎng)基）和對照組（n=15，a-MEM培養(yǎng)基）進(jìn)行，每3d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)板上，觀察細(xì)胞生長情況，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞貼壁生長，分布均勻，形態(tài)多樣，豐富的胞質(zhì)向外生長出生長突，細(xì)胞核清晰，呈圓形或卵圓形。

1.4??Western?blot法檢測成骨細(xì)胞中的RANKL、OPG、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)

在進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)取樣前3d換液，并在實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入濃度為75ng/μl的Periostin。收集成骨細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，4℃?12?000r/min?15min離心，取上清于新離心管中，蛋白定量，根據(jù)RANKL、OPG、Beclin-1、LC3蛋白大小配置不同的濃度的SDS-PAGE膠，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺凝膠法電泳，電泳完成后在4℃?100V的條件下2h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取出PVDF膜，4℃過夜。加入第一抗體Beclin-1（1∶300）、LC3（1∶300）、OPG（1∶100）、RANKL（1∶85），4℃過夜。孵育完成后，PBS洗滌PVDF膜3次，分別加入第二抗體兔抗，其中RANKL為鼠抗IgG（1∶2000），室溫孵育1h，PBS洗滌3次，X線曝光、顯影、定影，結(jié)果分析。內(nèi)參選用GAPDH（小鼠，上海Santa?Cruz生物技術(shù)有限公司，1∶2000，36kDa）。

1.5??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??臨床標(biāo)本原位雜交結(jié)果分析

滯留乳牙根尖周炎組織中Periostin的表達(dá)水平明顯低于正常牙槽骨組織（0.18±0.01?vs.?0.26±0.04，P<0.05）；正常牙槽骨組織中RANKL、RANKL/OPG、LC3、BECN1均顯著低于滯留乳牙根尖周炎組織（0.16±0.01?vs.?0.23±0.02，P<0.05；0.84±0.16?vs.?1.35±0.07，P<0.05；0.21±0.02?vs.?0.30±0.03，P<0.05；0.16±0.03?vs.?0.31±0.04，P<0.05）；滯留乳牙根尖周病組織和正常牙槽骨組織中OPG的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.17±0.03?vs.?0.19±0.01，P>0.05）。見表1，圖1。

2.2??Western?blot法檢測體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞結(jié)果分析

體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞貼壁生長，分布均勻，形態(tài)多樣，豐富的胞質(zhì)向外生長出生長突，細(xì)胞核清晰，呈圓形或卵圓形。見圖2。

培養(yǎng)基中含Periostin的實(shí)驗(yàn)組RANKL、RANKL/OPG、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均較對照組表達(dá)水平低（0.57±0.03?vs.?0.72±0.05，P<0.05；0.56±0.01?vs.?0.64±0.04，P<0.05；0.89±0.11?vs.?1.28±0.20，P<0.05；0.96±0.04?vs.?1.26±0.05，P<0.05，0.86±0.06?vs.?1.19±0.09，P<0.05）。兩組OPG、LC3Ⅰ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.02±0.12?vs.?1.12±0.10，P>0.05；1.20±0.10?vs.?1.06±0.09，P>0.05），Periostin

能夠降低RANKL、RANKL/OPG和自噬水平，見表2，圖3。

3??討論

乳恒牙替換過程需要骨吸收與骨形成的相互作用，部分乳牙根尖周炎會引起牙根根尖及周圍牙槽骨病變吸收，而由于炎癥的作用，骨形成未能正常進(jìn)行，部分患者就會出現(xiàn)牙齒替換異常，嚴(yán)重影響了牙列完整和健康，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)牙齒萌出和成骨細(xì)胞分化的過程中，Periostin表達(dá)是明顯增加的[19-21]。但Periostin如何調(diào)節(jié)乳恒牙替換的具體機(jī)制仍不明確。

在乳恒牙替換時(shí)，乳牙根及其與恒牙胚之間的牙槽骨吸收形成萌出通道，同時(shí)，隨著恒牙胚的生長發(fā)育，恒牙牙根逐漸形成，并在牙胚周圍及根方形成新的牙槽骨[22-23]。RANKL/OPG的比值反映了骨吸收的活躍程度，因此在乳恒牙替換過程中，RANKL/OPG的比值維持在一個(gè)合理的區(qū)間，才能使替牙期間骨改建的正常進(jìn)行。在本研究顯示，根尖周炎標(biāo)本中的RANKL/OPG的比值明顯高于對照組，而Periostin表達(dá)卻低于對照組，另一部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，含Periostin培養(yǎng)基培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中，RANKL/OPG的比值明顯低于對照組，二者均表明Periostin的表達(dá)水平與RANKL/OPG時(shí)負(fù)相關(guān)的。由此推測，Periostin對根尖周炎所致的骨吸收可能有一定的抑制作用。

自噬與炎癥之間存在密切聯(lián)系，細(xì)胞自噬既能夠通過自身生理活動清除入侵的病原體，也會因?yàn)檫^強(qiáng)的細(xì)胞自噬消耗過多的自噬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而減弱線粒體自噬，從而引起活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）積累，激活炎癥小體[24-25]。在本研究中，病原體入侵引起根尖周組織的炎癥，LC3和BECN1的mRNA表達(dá)水平證實(shí)了炎癥標(biāo)本中較強(qiáng)的細(xì)胞自噬，對照組中Periostin表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組，另一部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)基中含Periostin的成骨細(xì)胞中的Beclin-1水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，表明Periostin表達(dá)水平與自噬是負(fù)相關(guān)的，提示Periostin可能可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，主要是以降低過強(qiáng)自噬使其達(dá)到一個(gè)相對正常的水平來降低炎癥對于骨吸收的損害狀況，從而保障成骨細(xì)胞的正常功能，達(dá)到乳恒牙正常替換的目的。

Periostin如今已經(jīng)被廣泛用于骨組織損傷的治療中，它能夠加速損傷愈合，加快骨代謝的速度，Periostin對于組織損傷修復(fù)的作用有一部分是通過降低或者抑制損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的[26-27]。此外，研究表明Periostin的過表達(dá)能夠上調(diào)骨形成速率和骨量，提示Periostin既能夠抑制骨吸收，也能促進(jìn)骨形成[28]。

綜上，Periostin一方面可能通過抑制由于炎癥導(dǎo)致的過多RANKL的產(chǎn)生，使RANKL/OPG比值減小，使骨吸收活動減弱；另一方面，Periostin可以調(diào)低過強(qiáng)的細(xì)胞自噬活動來改善嚴(yán)重的乳牙根尖周炎環(huán)境，從而減少因炎癥導(dǎo)致的骨吸收過多。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] KUDO?A.?Periostin?in?bone?biology[J].?Adv?Exp?Med，?2019，?1132：?43–47.

[2] DUCHAMP?D?L?O，?COLNOT?C.?Periostin?in?bone?regeneration[J].?Adv?Exp?Med?Biol，?2019，?1132：?49–61.

[3] 吳曉珊，?王福，?李昂，?等.?哺乳動物雙牙列替換模式及調(diào)控機(jī)制[J].?中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，?2020，?55（6）：?367–372.

[4] 呂晶，?劉英群.?RANKL在人乳牙根生理性吸收過程中的表達(dá)[J].?口腔醫(yī)學(xué)研究，?2006，?22（5）：?492–494.

[5] DECASTRO?L?F，?BURKE?A?B，?WANG?H?D，?et?al.?Activation?of?RANK/RANKL/OPG?pathway?is?involved?in?the?pathophysiology?of?fibrous?dysplasia?and?associated?with?disease?burden[J].?J?Bone?Miner?Res，?2019，?34（2）：?290–294.

[6] PITARI?M?R，?ROSSI?M，?AMODIO?N，?et?al.?Inhibition?of?miR-21?restores?RANKL/OPG?ratio?in?multiple?myeloma-derived?bone?marrow?stromal?cells?and?impairs?the?resorbing?activity?of?mature?osteoclasts[J].?Oncotarget，?2015，?6（29）：?27343–27358.

[7] ZHAO?C，?CAI?X，?WANG?Y，?et?al.?NAT1?promotes?osteolytic?metastasis?in?luminal?breast?cancer?by?regulating?the?bone?metastatic?niche?via?NF-κB/IL-1B?signaling?pathway[J].?Am?J?Cancer?Res，?2020，?10（8）：?2464–2479.

[8] 周焱，?王穎慧，?趙煥英，?等.?IL-17在乳牙根尖周病損組織中的表達(dá)[J].?口腔醫(yī)學(xué)研究，?2020，?36（4）：?365–368.

[9] CECCONI?F，?LEVINE?B.?The?role?of?autophagy?in?mammalian?development：?cell?makeover?rather?than?cell?death[J].?Dev?Cell，?2008，?15（3）：?344–357.

[10] LEVINE?B，?KROEMER?G.?Autophagy?in?the?pathogenesis?of?disease[J].?Cell，?2008，?132（1）：?27–42.

[11] NETEA-MAIER?R?T，?PLANTINGA?T?S，?VAN?D?V?F?L，?et?al.?Modulation?of?inflammation?by?autophagy：?consequences?for?human?disease[J].?Autophagy，?2016，?12（2）：?245–260.

[12] KRAKAUER?T.?Inflammasomes，?autophagy，?and?cell?death：?The?trinity?of?innate?host?defense?against?intracellular?bacteria[J].?Mediators?Inflamm，?;2019，?2019：?2471215.

[13] IZUHARA?K，?NUNOMURA?S，?NANRI?Y，?et?al.?Periostin?in?inflammation?and?allergy[J].?Cell?Mol?Life?Sci，?2017，?74（23）：?4293–4303.

[14] UNAL?TD，?HAMURCU?Z，?DELIBASI?N，?et?al.?Thymoquinone?inhibits?proliferation?and?migration?of?MDA-MB-231?triple?negative?breast?cancer?cells?by?suppressing?autophagy，?Beclin-1?and?LC3[J].?Anticancer?Agents?Med?Chem，?2021，?21（3）：?355–364.

[15] MATHEW?B，?CHENNAKESAVALU?M，?SHARMA?M，?et?al.?Autophagy?and?post-ischemic?conditioning?in?retinal?ischemia[J].?Autophagy，?2021，?17（6）：?1479–1499.

[16] TANIDA?I，?UENO?T，?KOMINAMI?E.?LC3?and?autophagy[J].?Methods?Mol?Biol，?2008，?445：?77–88.

[17] SHAN?X，?LV?Z?Y，?YIN?M?J，?et?al.?The?protective?effect?of?cyanidin-3-glucoside?on?myocardial?ischemia-?reperfusion?injury?through?ferroptosis[J].?Oxid?Med?Cell?Longev，?2021，?2021：?8880141.